一种类囊体蛋白质的提取方法与流程

本申请属于生物分离工程技术领域，特别是涉及一种类囊体蛋白质的提取方法。

背景技术：

类囊体是植物进行光合作用的光反应场所，位于叶绿体内，由基粒片层和基质片层所组成。基粒片层是由许多扁平的、直径为400nm左右的囊状结构上下垛叠而成，基质片层连接着基粒类囊体。叶绿素和其他色素分布在类囊体的膜上。光合作用所需的各种酶、蛋白质、光复合体psⅰ、光复合体psⅱ等分布于基粒的膜上或者基质中。类囊体是一个互相连接沟通的网络结构，其内复杂的折叠膜系统大大增加了光合作用的面积，从而提高了光合效率。

光合作用能够将活跃的太阳能转换为稳定的化学能，这一过程发生在植物叶绿体中，通过两种类囊体膜整合蛋白复合体psⅰ和psⅱ、细胞色素b6f复合体、atp合酶、捕光天线复合体(lhcs)ⅰ和ⅱ、以及一些辅助蛋白协同作用来进行实现。类囊体上分布的这些蛋白复合体是光能吸收、传递和转换的关键结构。为了深入研究类囊体上这些蛋白质的晶体结构和生理功能以及类囊体的生物学功能，提取类囊体进行分析具有重要的理论价值和实践意义。但是目前还没有对类囊体蛋白质进行提取的方法。

技术实现要素：

1.要解决的技术问题

基于为了深入研究类囊体上这些蛋白质的晶体结构和生理功能以及类囊体的生物学功能，提取类囊体进行分析具有重要的理论价值和实践意义。但是目前还没有对类囊体蛋白质进行提取的方法的问题，本申请提供了一种类囊体蛋白质的提取方法。

2.技术方案

为了达到上述的目的，本申请提供了一种类囊体蛋白质的提取方法，所述方法包括如下步骤：

1)将叶片剪碎放入研磨缓冲液gb中，然后进行破碎；

2)分离破碎的叶片细胞中的叶绿体，获得纯度高、形态完整的叶绿体；

3)将需要进行组分分离的样品标注好，然后进行离心；

4)用含有蔗糖的1×tebuffer重悬用于组分分离的样品后，裂解叶绿体；

5)通过离心，把上清和沉淀分开，沉淀即为类囊体蛋白质。

本申请的另一种实施方式为：所述步骤1)中采用榨汁机进行破碎。

本申请的另一种实施方式为：所述步骤2)中，采用percoll密度梯度法分离破碎的叶片细胞中的叶绿体。

本申请的另一种实施方式为：所述步骤3)中离心采用离心机进行，所述离心机在使用前，将离心机温度调到4℃进行预冷。

本申请的另一种实施方式为：所述步骤4)中采用超低温反复冻融方法裂解叶绿体。

本申请的另一种实施方式为：还包括将所述类囊体蛋白质与上清蛋白质样品采用免疫印迹的方法进行检测。

3.有益效果

与现有技术相比，本申请提供的类囊体蛋白质的提取方法的有益效果在于：

本申请提供的类囊体蛋白质的提取方法，主要用于分析和研究类囊体蛋白质在各项生命活动中的重要功能及其作用机制，对阐述类囊体的生理功能及遗传规律具有重要的生物学意义。

本申请提供的类囊体蛋白质的提取方法，广泛适用于在拟南芥、烟草、小白菜等相关植物中提取类囊体蛋白质，对深入了解类囊体的生物学功能和增加光合作用效率具有重要的理论价值和现实意义。

附图说明

图1为本申请类囊体蛋白质的提取方法流程示意图；

图2为本申请的类囊体蛋白质免疫印迹实验结果示意图。

具体实施方式

在下文中，将参考附图对本申请的具体实施例进行详细地描述，依照这些详细的描述，所属领域技术人员能够清楚地理解本申请，并能够实施本申请。在不违背本申请原理的情况下，各个不同的实施例中的特征可以进行组合以获得新的实施方式，或者替代某些实施例中的某些特征，获得其它优选的实施实施方式。

percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone,pvp)处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。

参见图1～2，本申请提供一种类囊体蛋白质的提取方法，所述方法包括如下步骤：

1)将叶片剪碎放入研磨缓冲液gb中，然后进行破碎；

2)分离破碎的叶片细胞中的叶绿体，获得纯度高、形态完整的叶绿体；

3)将需要进行组分分离的样品标注好，然后进行离心；

4)用含有蔗糖的1×tebuffer重悬用于组分分离的样品后，裂解叶绿体；

5)通过离心，把上清和沉淀分开，沉淀即为类囊体蛋白质。

进一步地，所述步骤1)中采用榨汁机进行破碎。

进一步地，所述步骤2)中，采用percoll密度梯度法分离破碎的叶片细胞中的叶绿体。

进一步地，所述步骤3)中离心采用离心机进行，所述离心机在使用前，将离心机温度调到4℃进行预冷。

开始提取前，需要配制研磨缓冲液gb、重悬缓冲液rb、5×loadingbuffer及1×tebuffer；打开离心机，将温度调到4℃进行预冷；洗净各类离心管、漏斗和尼龙网并吹干。

进一步地，所述步骤4)中采用超低温反复冻融方法裂解叶绿体。

进一步地，还包括将所述类囊体蛋白质与上清蛋白质样品采用免疫印迹的方法进行检测。

实施例

1)实验准备工作：配制适量研磨缓冲液gb(50mmhepes/koh,ph7.5；0.33msorbitol；1mmmgcl2；1mmmncl2；2mmedta,ph8.0；5mmna-ascorbate；0.1％bsa)、重悬缓冲液rb(50mmhepes-koh,ph7.9；0.33msorbitol；0.8mmcacl2；5mmna-ascorbate)、5×loadingbuffer(1mtris/hcl,ph6.8；50％甘油；10％sds；5％β-巯基乙醇；0.5％溴酚蓝)及1×tebuffer(10mmtricine-koh,ph7.5；2mmedta)；打开离心机，将温度调到4℃进行预冷；洗净各类离心管、漏斗和尼龙网并吹干。

2)采用榨汁机提取叶绿体：取5g叶片，剪碎到约80mlgb中，然后用榨汁机打碎，3次点动，每次5s。将所得溶液过滤到圆底的大离心管中，2000×g离心1-2min，弃上清，加500μlrb重悬沉淀。将重悬液小心地加到配好的percoll中(下层1ml90％的percoll+上层2ml40％的percoll)，2000×g离心15min，叶绿体分为两层，上层为破碎的叶绿体，下层为完整的叶绿体，小心吸取下层完整叶绿体到新的离心管中，再加入2mlrb，混匀，400×g离心3min，弃上清，加入适量rb重悬叶绿体。

3)标注与离心：取200μl的叶绿体溶液，置于1.5ml离心管中，标注“叶绿体总蛋白”；再取200μl的叶绿体溶液，标注“用于分组分”。4℃，3000×g离心3min。

4)叶绿体的裂解：两份样品均弃去上清，“叶绿体总蛋白”中加入100μl2×loadingbuffer，混匀，95℃加热5min，室温冷却。用135μl含有0.6m的蔗糖的1×te重悬“用于分组分”的样品，重悬完后4℃放置10min。转移样品至-80℃冰箱中，放置30min，取出后于37℃化冻1min，轻弹混匀。再次转移样品至-80℃冰箱中，放置30min，取出后于37℃化冻1min，轻弹混匀。第三次将转移样品至-80℃冰箱中，放置30min，取出后于37℃化冻1min，轻弹混匀。

5)类囊体的获得：加入27μl1×tebuffer，并混匀。4℃，3000×g，离心3min。将上清转移到新的离心管中，置于冰上，留存。加入40μl5×loadingbuffer，标记为“上清”。沉淀用1ml1×tebuffer洗两次(4℃，3000×g，离心3min)。弃去上清，沉淀用100μl2×loadingbuffer重悬，该溶液即为类囊体。类囊体蛋白和上清蛋白样品均95℃加热5min，室温冷却。

6)类囊体蛋白质的鉴定：将所得到的叶绿体总蛋白、类囊体蛋白、上清蛋白样品一起上样，进行免疫印迹实验，检测类囊体蛋白质的提取质量。结果如图2所示：该方法可获得分离纯度较高的类囊体蛋白质。

尽管在上文中参考特定的实施例对本申请进行了描述，但是所属领域技术人员应当理解，在本申请公开的原理和范围内，可以针对本申请公开的配置和细节做出许多修改。本申请的保护范围由所附的权利要求来确定，并且权利要求意在涵盖权利要求中技术特征的等同物文字意义或范围所包含的全部修改。