抗病基因OsRLR1、转录因子OsWRKY19以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因osrlr1、转录因子oswrky19以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

背景技术：

目前水稻白叶枯病的防治主要依赖于传统的化学药剂，但其环保及抗药性问题日益严重。而新兴的生物防治由于拮抗微生物筛选困难、防治效果不稳定以及成本较高而很难得到推广和应用(陈立华etal.，2014；刘薇，杨超，邹剑锋&宋娟，2009)。目前的研究挖掘了一些白叶枯病抗性的qtl位点，而关于水稻白叶枯病抗性分子机制的研究甚少。因而筛选水稻白叶枯病抗性基因并应用于分子育种，产生高产高抗水稻品种，而较少农药的使用，既使农民增收也能保护环境(wasano&hirota，1986)。

植物在生长和发育过程中受到各种生物和非生物胁迫。为了阻止病菌的侵害，植物进化了复杂的两个防御系统(dangl&jones2001年；matzinger2002年)。当病原体突破植物细胞壁的防御时，病菌的保守结构，如鞭毛蛋白，几丁质和肽聚糖，通过模式识别植物体的prr受体，激活植物体的第一道免疫系统—pti(zipfel&felix2005；kaku等人。2006年；liu等人。2012年)。当病原体试图绕过pti的抑制进一步侵染植物时，就会分泌一些无毒的效应因子，来麻木植物的免疫系统。但无毒的效应因子可以被特异的植物体内的抗病蛋白(r)识别，进而激活植物体的第二道防御系统eti(belkhadir等，2004年)。为了提高植株的整体抗性，由信号分子水杨酸(sa)介导的系统获得性抵抗(sar)可以持久的激活植物体的免疫反应，防止病菌的进一步侵染。抗病反应由于r基因突变的持续激活通常会导致活性氧(ros)爆发和过敏性抵抗(hr)细胞死亡。

目前，白叶枯病的抗病机制相对于稻瘟病的研究较为浅显，而且克隆的抗病基因的基因家族并不固定，包括膜上的类受体prr蛋白和抗病基因r蛋白(liuetal.,2014)。众所周知，白叶枯病作为水稻的三大病害之一，一旦发病对水稻的生长发育以及灌浆结实都有严重影响。所以，克隆相关的白叶枯病相关基因，并探究其作用机制和应用具有重要价值。目前克隆的白叶枯病的抗病基因仅有不到十个，因而克隆白叶枯病的抗性基因，并清晰的解析其抗性的作用机制对于白叶枯病抗病育种应用具有十分重要的理论意义与实践效果。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供水稻抗病基因osrlr1及编码蛋白、水稻转录因子oswrky19及编码蛋白，以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、水稻抗病基因osrlr1，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

2、水稻抗病基因osrlr1的编码蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

3、水稻转录因子oswrky19，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

4、水稻转录因子oswrky19的编码蛋白，其氨基酸序列如seqidno.4所示。

5、上述水稻抗病基因osrlr1或编码蛋白在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

6、上述水稻转录因子oswrky19或编码蛋白在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

7、上述水稻抗病基因osrlr1与水稻转录因子oswrky19的相互作用在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

优选的，所述水稻品种为缙恢10号。

本发明的有益效果在于：

申请人发现缙恢10号的遗传背景下突变osrlr1(loc_os10g07978)基因后的突变体rlr1对白叶枯病的抗性增强。本发明利用分子生物学与生物化学技术表明超量表达osrlr1增强了对白叶枯病的抗性。osrlr1与转录因子oswrky19发生了蛋白质的相互作用。为了进一步研究，本发明利用转基因技术在突变体rlr1中，干涉基因oswrky19的表达，得到了纯合的转基因植株。由抗病反应持续激活导致的转基因植株的表型和农艺性状均得到不同程度的恢复。白叶枯病接种实验也表明：超表达osrlr1能够增强植株对白叶枯病的抗病性。同时，干涉基因oswrky19的表达后，转基因植株对白叶枯病的抗性减弱，因而osrlr1和oswrky19发生蛋白质的相互作用，且均能增强对白叶枯病的抗性反应。

水稻抗病基因osrlr1的突变导致了叶片出现褐色的类病斑，增强了水稻病程相关基因的表达，激活了体内的免疫反应，对白叶枯病的抗性增强。在野生型中，超量表达osrlr1对白叶枯病的抗性增强。在突变体rlr1中，干涉基因oswrky19的表达，导致了突变体rlr1对白叶枯病的抗性减弱。本发明清晰地解析了osrlr1抗白叶枯病的作用机制是由基因oswrky19的发生蛋白质的相互作用而介导的，并且，oswrky19能够直接激活抗病反应最下游的病程相关基因ospr10(基因编号：loc_os12g36880)的表达，直接激活水稻的防御反应。因此，本发明为增强水稻的白叶枯病抗病性和提高水稻产量开辟新的途径。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为野生型(wt)和突变体rlr1对白叶枯病的抗性；

a：野生型(左)和rlr1突变体(右)的叶片在接种白叶枯病后的表型；b：野生型和osrlr1突变体在接种白叶枯病后第5,10,15天的病斑长度统计；c：野生型和osrlr1突变体在接种白叶枯病后第15天的生物量统计。

图2为超量表达osrlr1增强了对白叶枯病的抗性；

a:接种白叶枯病的野生型(左)、rlr1突变体(中)和超量表达osrlr1(右)水稻叶片；b:在接种白叶枯病后第5,10,15天的病斑长度统计；c:在接种白叶枯病后第15天的生物量统计。

图3为osrlr1蛋白与oswrky19蛋白相互作用；

a：以osrlr1的cc结构域为诱饵，通过酵母双杂交系统(y2h)筛选5种wrky蛋白：oswrky13，oswrky19，oswrky47，oswrky68和oswrky76。osrlr1的cc结构域(osrlr1cc)与oswrky19相互作用；b：oswrky19与osrlr1的不同截短蛋白之间互作。c：bifc法检测烟草叶片osrlr1-cyfp和oswrky19-nyfp、osrlr1-cyfp和nyfp、cyfp和oswrky19-nyfp的共表达。d：bifc法测定烟草叶片叶片osrlr1m-cyfp和oswrky19-nyfp、osrlr1m-cyfp和nyfp、cyfp和oswrky19-nyfp的共表达。

图4为在osrlr1的突变体内干涉基因oswrky19的表型分析；

a：oswrky19在突变体遗传背景下干涉wrky19的t0代植株中的相对表达，l1-l4是不同的转基因系。b-d：野生型、rlr1和纯合子干涉wrky19的植株分蘖期的植株表型。e-g：野生型、rlr1和纯合子干涉wrky19的植物的叶片；1、2和3代表从上到下的倒一叶、倒二叶和倒三叶。h：野生型、rlr1和纯合子干涉wrky19的植株叶片的dab染色；2和3自上而下代表倒二叶和倒三叶。i：成熟期的：野生型、rlr1和纯合子干涉wrky19的植株。j：成熟期野生型、rlr1和纯合子干涉wrky19的植株的稻穗。

图5为在osrlr1的突变体内干涉基因oswrky19的农艺性状分析；

a：株高(cm)；b：有效穗数；c：一次枝梗数；d：二次枝梗数；e：穗长(cm)；f：每穗实粒数；g：结实率；h：千粒重(g)。

图6为野生型和突变体rlr1内干涉基因oswrky19转基因植株接种白叶枯病表达分析；在接种白叶枯病后第五天，野生型(左)，突变体rlr1(中)，干涉oswrky19转基因植株(后二)的抗病相关基因npr1,pr1a和pr10的表达分析。

图7为野生型和突变体rlr1内干涉基因oswrky19转基因植株接种白叶枯病统计分析；

a：野生型、突变体rlr1和干涉oswrky19转基因植株的叶片在接种白叶枯病后的表型；b：野生型、突变体rlr1和干涉oswrky19转基因植株在接种白叶枯病后第5,10,15天的病斑长度统计；d：野生型、突变体rlr1和干涉oswrky19转基因植株在接种白叶枯病后第15天的生物量统计。

图8为转录因子oswrky19激活病程相关基因pr10的表达；

a：在水稻原生质体中，oswrky19具有转录活性；b：病程相关基因pr10的启动子元件分析；c：转录因子oswrky19能够激活pr10的表达；d：osrlr1能够增强oswrky19对pr10启动子激活。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号(wt)和突变体rlr1(xingetal.,2016)，均由本实验室培育；本研究中使用的各种限制性内切酶和t4连接酶(d2011a)均购自大连takara生物工程有限公司；各种快速限制性内切酶、peasy-uniseamlesscloningandassembly重组酶及dnamarker购自北京全式金生物技术有限公司；其他的化学试剂，如蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、氯化钙、ctab、tris-hcl、edta、氯化钠、丙烯酰胺、temed、琼脂粉、x-glu主要购自于美国sigma公司和上海生工生物工程股份有限公司；通用型dna纯化回收试剂盒(universaldnapurificationkit)，质粒提取试剂盒(tianprepminiplasmidkit)均购自天根生化科技(北京)有限公司，rna提取试剂盒(eastepsuper总rna提取试剂盒)和rna反转录试剂盒(goscript逆转录mix,oligo(dt))均购自美国promega公司；实时定量pcr(sybrpremixdimereraser试剂盒)购自大连takara生物工程有限公司；引物合成和dna测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；ptck303、pan580植物表达载体、大肠杆菌dh5α、农杆菌lba4404在biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买。酵母双杂交的ddo和qdo培养基均从生工生物技术公司购买。

实施例1、水稻野生型和突变体rlr1对白叶枯病的抗性分析

利用缙恢10号的遗传背景下突变基因osrlr1(loc_os10g07978)后的突变体rlr1与缙恢10号为野生型的对照，在分蘖期接种白叶枯病(zhe173,由中国水稻研究所提供)。结果发现：野生型的病斑长度远远高于突变体rlr1(图1中a)。在接种白叶枯病后第5,10,15天进行了病斑长度统计，统计结果也表明：野生型的病斑长度随着时间的推移，在不断地变长，而突变体rlr1的病斑长度不仅远小于野生型，而且变化不大(图1中b)。而在接种白叶枯病后第15天进行的白叶枯病菌生物量统计也发现野生型中的菌落数要远远高于突变体rlr1(图1中c)。

综上所述，osrlr1是一个参与了白叶枯病抗性的抗性基因，其突变体是功能获得性突变体，并增强了对白叶枯病的抗性。

实施例2、超量表达osrlr1增强了水稻对白叶枯病的抗性

利用在缙恢10号(已推广品种)的遗传背景下的超量表达osrlr1的转基因植株接种白叶枯病菌。结果表明：与野生型相比，超表达osrlr1植株的叶片病斑长度更短(图2中a)。而在接种后5,10和15天的统计结果也表明，超表达osrlr1植株的病斑长度与野生型相比均更短(图2中b)。同时，在接种后15天的叶片中白叶枯病菌的生物量统计结果也表明：超表达植株叶片中的白叶枯病菌更少(图2中c)。因而，抗病基因osrlr1能够增强水稻对白叶枯病的抗病性。

实施例3、osrlr1与转录因子oswrky19互作

鉴于clr家族的基因通常通过其cc结构域与wrky家族的转录因子互作来发挥防御作用，因此选择了5种wrky基因：oswrky13(loc_os01g54600)，oswrky19(loc_os05g49620)，oswrky47(loc_os07g48260)，oswrky68(loc_os04g51560)和oswrky76(loc_os09g25060)，通过酵母双杂交系统(y2h)筛选与osrlr1的cc结构域(osrlr1cc)相互作用的蛋白。由于全长的wrky蛋白通常在酵母中具有毒性(inoue等人，2013)，因此在本发明中使用了截短的蛋白(去除了羧基)。共转化的酵母均可以在ddo培养基上生长(图3中a)，但是只有oswrky19能与osrlr1cc互作而在缺陷培养基qdo/aba上生长(图3中a右)。为了进一步验证我们的实验结果，osrlr1和osrlr1(e318v)的截短与野生型和突变型的两个全长(fl)蛋白分别与oswrky19共转化酵母。结果发现所有转化的酵母均可以在ddo培养基上生长(图3中b)。来自osrlr1和osrlr1(e318v)的所有截短蛋白都可以与截短的oswrky19互作，而全长osrlr1或osrlr1(e318v)都不能与截短的oswrky19相互作用(图3中b)。所用克隆基因所用引物序列见表1。

表1.引物序列

申请人通过双分子荧光互补(bifc)验证了osrlr1和oswrky19之间的互作。具体方法为：以osrlr1bifc-f：5′-gccggatccatggctgagggcgtcattggctc-3′(seqidno.20)和osrlr1bifc-r：5′-gccgtcgacttgtatcctttctgcagccagctcacc-3′(seqidno.21)为引物，扩增野生型基因osrlr1(loc_os10g07978)的cds片段，扩增产物连接到了pxy104表达载体(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建osrlr1-cyfp融合表达蛋白。

以oswrky19bifc-f：5′-gccggatccatggtggagctctgcggcg-3′(seqidno.22)和oswrky19bifc-r：5′-gcctctagactacagattctgaatctccgattgga-3′(seqidno.23)为引物，扩增野生型基因osrlr1(loc_os10g07978)的cds片段，扩增产物连接到了pxy106表达载体(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建oswrky19-nyfp融合表达蛋白。我们利用在共表达的osrlr1-cyfp和oswrky19-nyfp的本氏烟草叶片的细胞，28℃暗培养48h后，用蔡司激光扫描共焦显微镜来观察gfp和细胞核染料dapi的荧光。核中观察到yfp荧光信号(图3中c)，这与dapi信号高度吻合。与野生型一样，osrlr1(e318v)可以在细胞核内与oswrky19互作(图3中d)。我们的结果表明，osrlr1和osrlr1(e318v)都能在本氏烟草叶的细胞核中与oswrky19相互作用。

上述结果发现oswrky19通过与osrlr1互作来参与了其介导的免疫反应。因此，我们推测oswrky19可能对防御反应起到积极的调节作用。

实施例4、在osrlr1的突变体内干涉基因oswrky19转基因植株表型分析

为了确定oswrky19对osrlr1介导的白叶枯病的调控模式，通过在突变体rlr1中干涉基因oswrky19的表达，进行表型观察和抗病性的分析。具体方法为：以rnaiwrky19-f1：5′-gccggatcccgtcgtctaccttggcgaccacac-3′(seqidno.24)和rnaiwrky19-r1：5′-gccggtaccgcgagatgaaggagaagtagccgtc-3′(seqidno.25)以及rnaiwrky19-f2：5′-aaatgtttgaacggagctccgtcgtctaccttggcgaccacac-3′(seqidno.26)rnaiwrky19-r2：5′-attttcaatcgatactagtgcgagatgaaggagaagtagccgtc-3′(seqidno.27)为引物，扩增oswrky19基因loc_os05g49620的保守序列，扩增产物连接到了pdck303表达载体(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建oswrky19-rnai干涉载体，并将质粒转化到农杆菌中，通过农杆菌侵染突变体的rlr1愈伤组织，进一步得到了以突变体rlr1为背景的oswrky19-rnai转基因植株。

首先，通过实时荧光定量分析了oswrky19在t0代中的表达量，与突变体相比，oswrky19的表达量在l1-l4不同的转基因系均降低，表明已经被成功干涉(图4中a)。在分蘖期时，纯合的干涉oswrky19的转基因植株的表型，同突变体相比也得到了一定程度的恢复，但仍不及野生型的生长发育水平(图4中b-d)。同时，纯合的干涉oswrky19的转基因叶片的细胞死亡的表型也得到了很大程度的恢复(图4中e-g)，而dab染色的结果的也表明纯合的干涉oswrky19的转基因叶片中积累的活性氧更少，叶片早衰的表型也得到了恢复(图4中h)。在成熟期，纯合子干涉oswrky19的植株的株高和分蘖数(图4中i)，穗长(图4中j)都大于突变体，但仍不及野生型。

对于oswrky19的表达分析是利用表2的引物进行的实时荧光定量分析。以ubiquitin为内参反应体系为：在25μl的反应体系中加入2μl的cdna模板，2μl引物，12.5μlsybrgreen荧光染料和8.5μlrnase-freeh2o，在bio-rad荧光定量pcr仪上进行荧光定量扩增；扩增条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸1分钟，40个循环；最后72℃延伸10分钟，然后利用cfx-manager软件进行数据的收集与处理。

表2.引物序列

实施例5、突变体内干涉基因oswrky19纯合转基因植株的农艺性状分析

对其中干涉基因oswrky19转基因发育最好的一个株系进行了农艺性状分析。我们在同一块大田，按同样的标准(每丛一株，间距4×7寸)种植。成熟后，进行拷种分析。结果表明：干涉基因oswrky19纯合转基因植株与rlr1相比，要极显著的高于rlr1，但仍然极显著的低于野生型(图5中a)。而对于有效穗数，干涉基因oswrky19纯合转基因植株与野生型相比没有显著差异，但极显著的多于突变体(图5中b)。此外，对于一次枝梗数、二次枝梗数，穗长、每穗实粒数和结实率，干涉基因oswrky19纯合转基因植株都要极显著的多于突变体，但仍然极显著的低于野生型(图5中c-g)。而对于千粒重，干涉基因oswrky19纯合转基因植株与rlr1相比，显著升高，但仍然极显著的低于野生型的千粒重(图5中h)。

实施例6、oswrky19介导白叶枯病抗性的分子机制研究

我们对在突变体rlr1内干涉基因oswrky19纯合转基因植株的白叶枯病抗病性进行了分析。在叶片接种白叶枯病菌后5天，取材利用上述的实时荧光定量的方法分析了抗病相关基因的表达。结果表明，在突变体rlr1内干涉基因oswrky19后，突变体对白叶枯病菌的抗病性得到了减弱，尽管与野生型相比，npr1,pr1a和pr10的表达量被激活得更高(图6)。但是低于突变体rlr1中的npr1,pr1a和pr10的表达量(图6)，表明oswrky19正调控了osrlr1介导的抗病反应。相关基因的定量引物见表3。

表3.引物序列

在接种白叶枯病后第5，10，15天进行了的病斑长度统计，统计结果也表明：与突变体相比，在突变体rlr1内干涉基因oswrky19纯合转基因植株的病斑长度均更高，随着时间的推移，病斑长度也在不断的增长，但是仍然小于野生型的病斑长度(图7中a、b)。而在接种白叶枯病后第15天进行了的白叶枯病菌生物量的统计也发现在突变体rlr1内干涉基因oswrky19纯合转基因植株的菌落数要远远高于突变体rlr1，但仍然低于野生型(图7中c)。为了进一步分析oswrky19抗白叶枯病的免疫机制，我们首先利用以oswrky19gal-f1：5′-gcccatatgatggtggagctctgcggcg-3′(seqidno.40)和oswrky19gal-r1：5′-gccggtaccctacagattctgaatctccgattggaa-3′(seqidno.41)克隆了并连接到在gal载体中，在原生质体中表达，利用promega的化学发光仪检测其转录激活水平。结果发现oswrky19具有转录激活活性(图8中a)。我们利用生物信息学的网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析了pr10的启动子的元件，发现其有wrky家族的结合位点(图8中b)。利用引物：pgeen-pr10-f：5′-gccaagcttgctggaatgataagcaatttgaaacgga-3′(seqidno.42)pgeen-pr10-r：5′-gccggatcccactctactgaccactgatgcctgtagc-3′(seqidno.43)克隆了pr10的约1000bp的启动子序列，并将其克隆到载体pgreen中。利用引物将oswrky19sl-f：5′-gccactagtatggtggagctctgcggcg-3′(seqidno.44)oswrky19sl-r：5′-gcctctagacagattctgaatctccgattggaa-3′(seqidno.45)克隆了基因的编码框，并克隆到pan580的载体上。在原生质体中共表达pr10的启动子和oswrky19，利用promega的化学发光仪检测其转录激活水平。结果发现oswrky19对pr10的启动子有转录激活作用(图8中c)。而同时分别加入野生型和突变体的osrlr1基因，均能增强对的激活作用，且突变的基因作用更强(图8中d)。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>西南大学

<120>基因osrlr1、转录因子oswrky19以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用

<130>2020

<160>45

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3139

<212>dna

<213>artificial

<400>1

aatttccccctcttttcatccatgactttttgtgcagtaaccagcatatagaacagtcac60

agtgttcattgtcacactcattagctcacaattcacagactctacacttgaaatggtgag120

aatcttatagctctggctagacaaccatggctgagggcgtcattggctcgttaatcctga180

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