识别EBV-LMP2抗原的TCR及相应的核酸分子、载体、细胞和药物的制作方法

本发明涉及t细胞技术领域，尤其是指一种识别ebv-lmp2抗原的tcr及相应的核酸分子、载体、细胞和药物。

背景技术：

eb病毒(epstein-barrvirus,ebv)是一种dna病毒，属于单纯疱疹病毒的亚型，广泛流行，据悉全世界大于90％的人ebv感染阳性(thompsonmpetal.,clinicalcancerresearch2004,10(3):803-821.)。ebv可以感染人b淋巴细胞和表皮细胞，其活动周期可分为裂解期和潜伏期。裂解期ebv进行dna复制并生产感染性颗粒。潜伏期的不同阶段(0、i、ii、iii)，ebv表达不同种类的病毒蛋白(macsweenkfetal.,thelancetinfectiousdiseases2003,3(3):131-140.)。大多数ebv感染者没有任何症状，但有少数感染人群会发生恶性肿瘤病变。目前发现与ebv潜伏感染密切相关的恶性肿瘤有鼻咽癌、burkitt淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤和胃癌等，这些肿瘤患者的癌细胞可表达不同潜伏周期的外源性ebv抗原，因而，ebv病毒抗原是t细胞介导的细胞免疫治疗的理想靶点。

ebv潜伏膜蛋白lmp1和lmp2的表达是维持病毒ii型潜伏感染状态及导致细胞恶性转化的关键。例如，lmp2a可在细胞质膜形成磷酸化酪氨酸聚合物，并与lyn，syk协同刺激b细胞受体信号传递，从而诱导pi3k/akt信号途径的活化(caldwellrgetal.immunity1998，9:405-411)。t细胞受体基因修饰的t淋巴细胞过继免疫疗法(adoptivecelltransfer，act)通过将可识别病毒/肿瘤抗原的tcr基因整合至患者t细胞中，使得原本不具备抗原特异性的患者t细胞可识别并杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的效用(jin,b.y.,etal.jciinsight2018,3(8)：e99488)。研究显示t细胞受体基因转导的t细胞能特异性地识别并杀伤ebv转化的lcl细胞；在荷瘤小鼠模型中，lmp2特异性tcr-t能显著抑制lmp2+肿瘤生长，在治疗鼻咽癌和移植后淋巴细胞增多症的i期临床试验中也证实了其应用的安全性和短期临床有效性(zhengy,etal.cancerimmunolres2015,3(10):1138-1147.)。

分离并鉴定ebv-抗原特异性的tcr，是进行ebv相关肿瘤免疫治疗的基础。不同的tcr与目标抗原结合的特异性和亲和力不同。制备得到的tcr-t细胞tcr蛋白的表达水平、免疫原性、肿瘤杀伤效用也不相同。这些抗原特异性tcr-t细胞的临床转化将让包括鼻咽癌、nk/t淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌等多种ebv阳性恶性肿瘤患者受益。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能识别并结合hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物的tcr及相应的核酸分子、载体、细胞和药物。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种识别ebv-lmp2抗原的tcr，用于特异性结合hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物；所述tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区；所述tcrα链可变区的cdr3氨基酸序列为caynligagsyqltf，示于seqidno：7，和/或所述tcrβ链可变区的cdr3氨基酸序列为cassslaggpneqff，示于seqidno：10。

其中，所述hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物由人白细胞表面抗原hla-a2及ebv-lmp2426-434短肽(clgglltmv)组成，表达于目标靶细胞表面。

进一步地，所述tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：αcdr1：tsesdyy，示于seqidno：5；αcdr2：qeaykqqn，示于seqidno：6；αcdr3：caynligagsyqltf，示于seqidno：7。

进一步地，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：βcdr1：sghta，示于seqidno：8；βcdr2：fqgnsa，示于seqidno：9；βcdr3：cassslaggpneqff，示于seqidno：10。

进一步地，所述tcrα链可变区的氨基酸序列为与seqidno：1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，和/或所述tcrβ链可变区的氨基酸序列为与seqidno：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

一种核酸分子，包含用于编码上述任一所述的识别ebv-lmp2抗原的tcr的核苷酸序列和/或相应的互补序列。

进一步地，所述核酸分子中，用于编码tcrα链可变区的核苷酸序列为seqidno：3，和/或用于编码tcrβ链可变区的核苷酸序列为seqidno：4。

进一步地，所述核酸分子中，用于编码所述tcrα链可变区的3个互补决定区的核苷酸序列为：αcdr1：示于seqidno：11；αcdr2：示于seqidno：12；αcdr3：示于seqidno：13。

进一步地，所述核酸分子中，用于编码所述tcrβ链可变区的3个互补决定区的核苷酸序列为：βcdr1：示于seqidno：14；βcdr2：示于seqidno：15；βcdr3：示于seqidno：16。

一种载体，包含上述任一所述的核酸分子。进一步地，所述载体为病毒载体。更进一步地，所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

一种细胞，转导上述任一所述的核酸分子、上述所述的载体中的一种或几种；该细胞表达结合hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物的特异性tcr。进一步地，所述细胞为干细胞或t细胞。

一种药物，其活性成分包含上述任一所述的识别ebv-lmp2抗原的tcr、上述任一所述的核酸分子、上述所述的载体、上述所述的细胞中的一种或几种。

进一步地，该药物用于治疗ebv阳性恶性肿瘤或eb病毒感染。进一步地，所述ebv阳性恶性肿瘤包括鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和胃癌。

本发明的有益效果在于：将识别ebv-lmp2抗原的tcr克隆至逆转录病毒载体后转染t细胞，cd8+t细胞的tcr转导率达19.8％；经过tcr基因修饰后的t细胞，能够特异性识别靶细胞并释放细胞因子，能够特异地识别低表达的hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物。

附图说明

图1为本发明的插入逆转录病毒载体的tcr序列元件结构示意图；

图2为本发明采用流式细胞术检测hla-a2-ebv-lmp2426-434特异性tcr(a4)基因修饰t细胞(tcr-t细胞)的转导效率的结果图；

图3为本发明采用elisa检测a4tcr-t细胞与靶细胞共培养后特异性释放细胞因子的能力的结果图；

图4为本发明采用elisa检测a4tcr-t细胞与hla-a*0201基因转导的人鼻咽癌细胞系c666-1a0201(hla-a2阳性且ebv-lmp2抗原阳性)共培养后，特异性释放细胞因子的能力的结果图。

具体实施方式

根据本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果的具体实施方式、配合附图详予进一步说明。

实施例

一种药物，其活性成分包含以下成分中的一种或几种：识别ebv-lmp2抗原的tcr、用于编码相应的识别ebv-lmp2抗原的tcr的核酸分子、包含相应的核酸分子的载体、转导相应的核酸分子或载体的细胞。该药物用于治疗ebv阳性恶性肿瘤或eb病毒感染。所述ebv阳性恶性肿瘤包括鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和胃癌。

一种识别ebv-lmp2抗原的tcr，用于特异性结合hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物；所述tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区；所述tcrα链可变区的cdr3氨基酸序列为caynligagsyqltf，示于seqidno：7，和/或所述tcrβ链可变区的cdr3氨基酸序列为cassslaggpneqff，示于seqidno：10。

进一步地，所述tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：αcdr1：tsesdyy，示于seqidno：5；αcdr2：qeaykqqn，示于seqidno：6；αcdr3：caynligagsyqltf，示于seqidno：7。

进一步地，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：βcdr1：sghta，示于seqidno：8；βcdr2：fqgnsa，示于seqidno：9；βcdr3：cassslaggpneqff，示于seqidno：10。

进一步地，所述tcrα链可变区的氨基酸序列为与seqidno：1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，和/或所述tcrβ链可变区的氨基酸序列为与seqidno：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

一种核酸分子，包含用于编码上述任一所述的识别ebv-lmp2抗原的tcr的核苷酸序列和/或相应的互补序列。

进一步地，所述核酸分子中，用于编码tcrα链可变区的核苷酸序列为seqidno：3，和/或用于编码tcrβ链可变区的核苷酸序列为seqidno：4。

进一步地，所述核酸分子中，用于编码所述tcrα链可变区的3个互补决定区的核苷酸序列为：αcdr1：示于seqidno：11；αcdr2：示于seqidno：12；αcdr3：示于seqidno：13。

进一步地，所述核酸分子中，用于编码所述tcrβ链可变区的3个互补决定区的核苷酸序列为：βcdr1：示于seqidno：14；βcdr2：示于seqidno：15；βcdr3：示于seqidno：16。

一种载体，包含上述任一所述的核酸分子。该载体为病毒载体，尤其指逆转录病毒载体或慢病毒载体。

一种细胞，为干细胞或t细胞。该细胞转导上述任一所述的核酸分子、上述所述的载体中的一种或几种。该细胞表达结合hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物的特异性tcr。

此外，所述hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物由人白细胞表面抗原hla-a2及ebv-lmp2426-434短肽(clgglltmv)组成，表达于目标靶细胞表面。

试验例1

hla-a2-ebv-lmp2426-434特异性t细胞的克隆及测序

利用化学合成的短肽clgglltmv(生工生物工程(上海)股份有限公司)体外刺激来源于hla-a*0201基因型的鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(pbmc)。经过2轮多肽刺激后，将多克隆t细胞(1×10⁵)与1×10⁵负载目标短肽(clgglltmv)或非目标短肽的t2细胞(靶细胞或对照细胞)于37℃共培养过夜。第二天检测培养上清中细胞因子ifn-γ的释放量。将阳性多克隆t细胞(靶细胞od450-对照细胞od450>1.0)用pe标记的hla-a2-ebv-lmp2426-434四聚体(mbl)染色后采用抗pe的磁珠(美天旎)分离四聚体阳性的细胞。对分离后的多克隆t细胞进行快速扩增：将t细胞与1ⅹ10⁷来自3名健康人的异源pbmc混合，并添加30ng/ml抗cd3抗体(okt3)，300u/ml人的il2。混合细胞置于含有10％胎牛血清的20mlx-vivo15培养液中培养，每隔两天，添加一次il2。连续培养14天后收获约1.5ⅹ10⁷t细胞。再次用pe标记的hla-a2-ebv-lmp2426-434四聚体(mbl)染色后采用抗pe的磁珠(美天旎)分离四聚体阳性的t细胞并进行免疫组库测序(苏州金唯智生物科技有限公司)。根据测序结果将测得频率最高的tcrα链及tcrβ链进行配对，pcr构建包含恒定区的全长tcr并插入逆转录病毒载体中。tcr序列的元件结构如图1所示。

其中，tcrα链可变区氨基酸序列为seqidno：1。

tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

αcdr1：tsesdyy，示于seqidno：5，

αcdr2：qeaykqqn，示于seqidno：6，

αcdr3：caynligagsyqltf，示于seqidno：7。

tcrα链可变区核苷酸序列为seqidno：3。

tcrα链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

αcdr1：accagcgagagcgattactac，示于seqidno：11，

αcdr2：caggaggcctacaagcagcagaac，示于seqidno：12，

αcdr3：tgcgcctacaacctgatcggcgccggcagctaccagctgaccttc，示于seqidno：13。

tcrβ链可变区氨基酸序列为seqidno：2。

tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

βcdr1：sghta，示于seqidno：8，

βcdr2：fqgnsa，示于seqidno：9，

βcdr3：cassslaggpneqff，示于seqidno：10。

tcrβ链可变区核苷酸序列为seqidno：4。

tcrβ链可变区的3个互补决定区核苷酸序列为：

βcdr1：agcggccacacagcc，示于seqidno：14，

βcdr2：tttcaggggaacagcgcc，示于seqidno：15，

βcdr3：tgcgccagctccagcctggccgggggccccaacgagcagtttttc，示于seqidno：16。

试验例2

制备hla-a2-ebv-lmp2426-434特异性tcr基因修饰的t细胞

将目标tcr克隆至逆转录病毒载体pmsgv1中(addgene)构建pmsgv1-a4tcr载体。转染病毒包装细胞系293gp细胞pmsgv1-a4tcr及pvsv-g质粒，制备逆转录病毒并采用病毒上清转导t细胞。

转染操作如下：第0天将293gp细胞接种至6孔板(6×10⁵/孔)；第1天，pmsgv1-a4tcr及pvsv-g质粒转染293gp细胞(2μgpmsgv1-a4tcr及1.4μgpvsv-g/孔)，同一天，采用抗人cd3抗体(okt3)活化健康人的pbmc；第3天，收集含病毒上清的培养液，并添加新鲜的培养液(含10％胎牛血清的dmem)至293gp细胞中；用收集的病毒上清离心转染活化后的t细胞；第4天采用同样的方法第二次转染活化的t细胞；第5天将转染后的t细胞收集至t25培养瓶中进行培养(培养液为含10％胎牛血清及300u/mlil2的x-vivo(lonza))。第7天流式检测目标tcr的表达水平，结果如图2所示，从图2中分析可知，cd8+t细胞的tcr转导效率(四聚体染色的阳性率)为19.8％。

试验例3

hla-a2-ebv-lmp2426-434特异性tcr基因修饰t细胞的体外功能验证

(1)elisa检测-1：c666-1细胞系来源于未分化型鼻咽癌，可检测到其持续性表达ebv编码的rna，包括ebna1，lmp1以及lmp2转录本。通过构建稳定表达gfp以及hla-a*0201的c666-1细胞系(c666-1gfp以及c666-1a0201)用于体外评价a4tcr-t细胞的功能。具体操作如下：将c666-1gfp，c666-1a0201细胞与a4tcr-t及对照t细胞分别进行共培养(37℃，16h)，取培养上清检测ifn-γ的释放量，检测结果如图3所示。从图3结果可知，对照t细胞不能识别c666-1a0201靶细胞，而tcr基因修饰后的t细胞能特异性识别靶细胞并释放细胞因子，表明该tcr为hla-a2限制性且可识别低表达的lmp2抗原。

(2)elisa检测-2：靶细胞的制备如下，将负载目标ebv-lmp2426-434多肽及对照多肽ebv-lmp2356-364的t2细胞(hla-a2⁺)分别与a4tcr-t细胞以及对照t细胞于37℃共培养16小时后，elisa检测培养上清ifn-γ的表达，检测如图4所示。从图4结果中可知，经hla-a2-ebv-lmp2426-434特异性tcr基因修饰的t细胞可特异性识别目标抗原表位并释放细胞因子。

综上所述，本发明提供的识别ebv-lmp2抗原的tcr及相应的核酸分子、载体、细胞和药物。将识别ebv-lmp2抗原的tcr克隆至逆转录病毒载体后转染t细胞，cd8+t细胞的tcr转导率达19.8％；经过tcr基因修饰后的t细胞，能够特异性识别靶细胞并释放细胞因子，能够特异地识别低表达的hla-a2-ebv-lmp2426-434抗原复合物。应用时，制备含有识别ebv-lmp2抗原的tcr以及相应的核酸分子、载体、细胞等活性成分的药物，能够特异性治疗ebv阳性恶性肿瘤或eb病毒感染。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110>深圳因诺免疫有限公司；深圳市因诺转化医学研究院

<120>识别ebv-lmp2抗原的tcr及相应的核酸分子、载体、细胞和药物

<130>123

<141>2020-06-12

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>116

<212>prt

<213>人(homosapiens)

<400>1

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151015

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202530

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354045

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65707580

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100105110

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115

<210>2

<211>115

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<400>2

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<211>348

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<213>人(homosapiens)

<400>3

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<210>4

<211>345

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<213>人(homosapiens)

<400>4

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<210>5

<211>7

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<213>人(homosapiens)

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<210>6

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15

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