Amuc1100蛋白的用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及amuc1100蛋白的用途。

背景技术：

正性情绪记忆能力和负性情绪记忆消退能力的增强对于机体的适应性至关重要，其损伤是创伤后应激障碍(ptsd)、广泛性焦虑障碍、抑郁症、社交恐惧和空间场所恐惧症等情绪记忆障碍的标志。研究认为，当形成一种新的正性情绪记忆来抑制最初的负性情绪记忆时，恐惧反应和低落情绪就会得到缓解。如根据巴甫洛夫条件反射原理建立起来条件性恐惧反应后，如果将受试再次暴露于之前的条件性刺激而没有预期的负性非条件性刺激，反复暴露之后，之前建立起来的条件性恐惧反应则会逐渐消失，这个过程称为负性情绪记忆的消退。进一步研究证明编码负性情绪记忆消退的功能形成并储存在一个独特的基底外侧杏仁核(bla)神经元群中，该神经元群通过驱动犒赏性记忆的行为来对抗bla最初的编码负性情绪记忆的神经元。在bla中，编码负性情绪记忆消退功能的神经元和编码奖赏性记忆(食物、爱情、性以及精神活性物质)的神经元显著重叠。此外，这两个神经元亚群在驱动犒赏行为和负性情绪消失行为方面的功能存在相互交换的现象。

近年来很多研究表明，肠道菌群能通过“脑-肠轴”影响学习记忆过程。研究发现肠道菌群对记忆的形成过程产生影响，如：感染鼠柠檬酸杆菌的小鼠在急性应激暴露后出现记忆功能的受损，而提前给予益生菌能抑制这种记忆功能的受损。益生菌的干预能改善糖尿病动物的空间学习记忆功能。无菌动物或经过抗生素处理的小鼠对恐惧记忆的消退受抑制。临床研究报道健康志愿者服用双歧杆菌1714菌株能显著促进其记忆功能。

噬粘蛋白艾克曼菌akkermansiamuciniphila(a.muciniphila)是肠道内常见的厌氧菌，相对丰度约3％～5％。通过基因组序列测定发现，在其基因组序列中存在许多编码黏蛋白降解酶的基因(超过61个，占总基因的11％)。蛋白质组学分析发现，在人的粪便中存在大量该菌用来降解胃肠道黏蛋白的酶，如：糖苷酶、硫酸酯酶和唾液酸苷酶等。amuc1100蛋白是aak的外膜蛋白，在与菌毛形成相关的基因簇上的存在，表明它可能参与宿主的互作。研究证明amuc_1100可以与阿克曼菌相似方式向表达tlr2的细胞发出信号，此外，amuc_1100表现出相对热稳定性，并同样可以观察到信号转导的作用。同样，最近的研究发现amuc_1100可以参与调节代谢，并抵御肥胖症缓解二型糖尿病。

研究发现，其与pd-1治疗癌症有效性、糖尿病、2型肥胖等代谢免疫性疾病显著相关，然而，本领域并无任何该菌与正性情绪记忆或负性情绪记忆之间关联的研究或报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供amuc1100蛋白对改善情绪记忆的应用，即增强正性情绪记忆同时促进负性情绪记忆消退的药物或者保健品中的应用。

本发明提供了amuc1100蛋白在制备改善情绪记忆的产品中的应用；

所述amuc1100蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示，或者在seqidno:1所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有amuc1100蛋白的活性的衍生蛋白。

本发明中，如seqidno:1所示氨基酸序列的amuc1100蛋白来自akkermansiamuciniphila菌(akk)，akk是一种从粪便中分离到的严格厌氧肠道菌，属疣微菌门，可以利用肠道黏蛋白作为唯一碳源和氮源进行生长，主要代谢产物为丙酸。通过序列测定方法对人肠道中的微生物进行分析发现，其中至少有8个菌株与a.muciniphila具有大于95％的相似性，称为akkermansia-like微生物(微生物学通报[j],2017,44,1458～1463)。ouwerkerk等从蟒蛇体内分离培养出了与akk基因序列具有94.4％相似度的新菌株，并且发现它们也具有相似的特性，并将该微生物命名为akkermansiaglycaniphila(doi:10.1099/ijsem.0.001399)。

本发明研究表明amuc1100蛋白或表达amuc1100蛋白的菌种，能够对情绪记忆起到改善作用。

一些实施例中，所述amuc1100蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示，或者在seqidno:1所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有amuc1100蛋白的活性的衍生蛋白。

表达amuc1100蛋白的宿主在制备改善情绪记忆的产品中的应用。

在本发明中，所述宿主为天然宿主或者为通过基因工程手段制备获得的重组宿主。其中，所述天然宿主为自然界存在的且能够表达表达amuc1100蛋白的微生物，例如，所述表达amuc1100蛋白的宿主为verrucomicrobia科的微生物；一些实施例中，所述verrucomicrobia科的微生物为akkermansiamuciniphila菌。应当理解，本发明的噬粘蛋白艾克曼菌，不仅包括akkermansiamuciniphila菌，还包括在核酸序列具有90％以上相似性的微生物，尤其是与a.muciniphila具有大于95％的相似性，被称为akkermansia-like的微生物。

另一些实施例中，所述宿主为表达amuc1100蛋白的重组宿主。例如，通过基因工程手段，使不表达amuc1100蛋白的宿主表达amuc1100蛋白，或者使低表达amuc1100蛋白的宿主产生更大量的amuc1100蛋白。所述基因工程手段包括但不限于zfns、talens或crispr/cas9；所述宿主包括但不限于细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。所述细菌选自大肠杆菌，在本发明实施例中，采用大肠杆菌bl21(de3)。所述哺乳动物细胞选自hek293细胞系。

在重组宿主中，所述amuc1100蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示，或者在seqidno:1所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有amuc1100蛋白的活性的衍生蛋白。所述在seqidno:1所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有amuc1100蛋白的活性的衍生蛋白可以为amuc1100除去信号肽之后的序列。一些实施例中，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

在重组宿主的构建过程中，为了使所述amuc1100蛋白更顺利的表达，本发明针对不同的宿主进行密码子优化。因此，本发明还提供了经过密码子优化的多核苷酸。在本发明中，表达seqidno:2所示氨基酸序列的多核苷酸序列如seqidno:3所示。

本发明还提供了构建重组宿主的核酸载体。本发明提供的核酸载体，包括骨架载体和编码amuc1100蛋白的多核苷酸。一些实施例中，所述骨架载体为pet-28a或pcdna4a(+)。

在一些具体实施例中，通过pcr扩增编码amuc1100除去信号肽之后的基因序列，将这段序列通过酶切酶连的方法克隆到pet-28a载体上，构建n-端融合6×his标签的amuc1100的表达质粒，利用大肠杆菌工程菌bl21(de3)菌株进行异源表达，该菌株在lb+kanr抗性的平板上过夜培养，挑选单克隆抗体，转接在含有100μg/mlkanr的5mllb培养液中，于37℃，180rpm培养4小时，在指数中期(0d600＝0.6)时1:100转入新培养基中，180rpm继续培养4小时后添加iptg至终浓度0.5-2mm，于28℃，180rpm诱导过夜。取菌液于8,000rpm离心5分钟沉淀细胞，菌体保存于-20℃。

本发明还提供了表达amuc1100蛋白的重组宿主，所述宿主为微生物或细胞株；所述amuc1100蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示，或者在seqidno:1所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有amuc1100蛋白的活性的衍生蛋白。本发明实施例中，所述宿主为大肠杆菌。具体为大肠杆菌工程菌bl21(de3)。

本发明实施例中，菌体在10倍体积超声裂解液中混匀，加入4ml含有溶菌酶、dnase/rnase和终浓度1mm的pmsf，混匀，冰上放置超声90min裂解破碎至溶液彻底清亮，将细胞裂解液离心12,000rpm、30min、4℃，收集上清放于冰上，即得到amuc1100重组蛋白，通过ni-16ntahis·bind树脂亲和层析纯化得到amuc1100蛋白，分装，储存在-80℃待用时配成合适的浓度。

本发明还提供了一种产品，其包括如下组分中的至少一种：

i)、如seqidno:1所示氨基酸序列的amuc1100蛋白；

ii)、在seqidno:1所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有amuc1100蛋白的活性的衍生蛋白；

iii)、表达i)或ii)所述蛋白的宿主；

iv)、iii)所述宿主的发酵产物；

v)、iii)所述宿主和/或v所述发酵产物的提取物；

vi)、具有改善情绪记忆的生物活性的其他物质。

本发明所述的产品为药物、食品或保健品。

本发明还提供了上述产品在改善情绪记忆中的应用。

在本发明中，所述改善情绪记忆包括促进负性情绪记忆的消退和/或增强正性情绪记忆；

所述负性情绪记忆的起因包括：重大疾病、灾难性时间、社交恐惧障碍、空间场所恐惧；

所述正性情绪记忆包括因健康、安全、食物、爱情、性快感等使心理生理上需求得到满足的正性情绪记忆。

本发明所述产品在制备成瘾戒断的药物中的应用，或在制备治疗焦虑症、强迫症、自闭症、痴呆、精神分裂症中至少一种的药物中的应用。

本发明提供的药物包括本发明所述的产品与药学上常用的辅料。

药学上可接受的辅料为水果粉、食用香精、甜味剂、酸味剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂中的一种或两者以上的混合物。

剂型为片剂、丸剂、口服液剂、胶囊剂、糖浆剂、滴丸剂或颗粒剂。

在本发明提供的一些实施例中，胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂。

在本发明提供的一些实施例中，片剂为口服片剂或口腔片剂。

口服片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥作用。在本发明提供的一些实施例中，口服片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。

本发明中，所述成瘾戒断包括因可卡因、甲基苯丙胺和阿片类物质引起的成瘾戒断。

本发明还提供了一种成瘾戒断的方法，或者治疗焦虑症、强迫症、自闭症、痴呆、精神分裂症的方法，其为给予本发明所述的产品。

经验证，在精神活性物质(如甲基苯丙胺)诱导的条件性位置偏爱大鼠模型中，精神活性物质本身没有对肠道菌群多样性或者akk的相对丰度有显著影响，但对精神活性物质犒赏作用敏感性及其相关环境线索记忆能力强的个体与低敏感性个体相比，akk相对丰度显著增加，且akk相对丰度越高，个体对精神活性物质犒赏作用敏感性越强及其相关环境线索记忆能力越强，二者呈正相关，可以作为对这些物质的戒断治疗中的应用，比如：制成药品或保健品。

将经广谱抗生素处理后的大鼠进行甲基苯丙胺诱导的条件性位置偏爱测试，我们发现，与对照组相比，经抗生素处理后的大鼠对精神活性物质犒赏作用敏感性及其相关环境线索记忆能力显著增加。与对照组相比，经广谱抗生素处理后的大鼠肠道菌群多样性和总体丰度都显著减少，而akk的相对丰度却显著增加。

条件性恐惧实验中，在akk相对丰度的显著增加的大鼠组中，恐惧记忆的消退过程中呈现出显著性消退加速。采用水迷宫评估空间学习记忆能力的差异，旷场实验评估其基础活动性或焦虑水平，组间未见显著差异。

本发明所述的产品中的任一种具有促进对正性情绪记忆体验增加同时改善情绪记忆(增强正性情绪记忆同时促进负性情绪记忆消退)的作用，可将其开发成微生物制剂，或作为添加剂用于制备保健品。

引起正性情绪记忆的情形包括：因健康、安全、食物、爱情、性快感等使心理生理上需求得到满足的多种情形。

引起的负性情绪记忆的情形包括：因重大疾病引发(如：焦虑症，抑郁症、强迫症、自闭症、痴呆和精神分裂症等)、因灾难性事件引发、因对物质(如：但不限于可卡因、甲基苯丙胺和阿片类物质等)成瘾引发、因社交恐惧引发、因空间场所恐惧引起、厌食症和偏执等，以及其中几种合并引发。

本发明研究表明amuc1100蛋白或表达amuc1100蛋白的宿主具有改善情绪记忆的作用，包括促进负性情绪记忆的消退和/或增强正性情绪记忆。能够用于制备成瘾戒断的药物中的应用，或在制备治疗焦虑症、强迫症、自闭症、痴呆、精神分裂症中至少一种的药物中的应用。

附图说明

图1为甲基苯丙胺(methamphetamine,ma)诱导的条件性位置偏爱(conditionedplacepreference,cpp)结果图，图中显示的p值经过student’st检验，其中a图为生理盐水组和ma暴露组大鼠cpp值，b图将ma暴露组按cpp值分为高cpp(h-cpp)组和低cpp(l-cpp)组；

图2为cpp训练后l-cpp和h-cpp组粪便微生物类群的差异结果，其中a图为l-cpp组与h-cpp组肠道微生物类群差异显著的门、科和属级箱式图，图中*p<0.05，**p<0.01，符合mann-whitneyu检验，b图为ldaeffectsize(lefse)分析柱状图，线性判别分析(lda)得分表示每一个差异类别的影响大小和排名，使用阈值2；

图3为经过cpp训练后cpp值与部分菌种相对丰度的相关性分析结果；

图4为生理盐水组、l-cpp组和h-cpp组akk从预测试期到测试期的变化结果；a图为cpp预测试及测试阶段akk的相对丰度及变化情况，b图展示了测试阶段akk的相对丰度相较于预测试阶段的差值；

图5为抗生素干预肠道菌群结果；图a显示抗生素可以显著提高大鼠在ma诱导的cpp实验中cpp值；图b为抗生素干预ma成瘾大鼠的肠道菌群可以显著改变肠道菌群多样性，样本alpha多样性结果以chao指数展示，反映群落丰富度，图c为lefse分析柱状图部分结果，lda得分反映组间在丰度上有显著差异的菌群的影响大小；

图6抗生素干预肠道菌群在条件性恐惧实验中的影响；图a和图c展示了大鼠形成条件性恐惧过程中的不动时间及不动时间百分比，图b和图d展示了大鼠条件性恐惧消退过程中不动时间及不动时间百分比，图c和图d的p值由计算每只大鼠的曲线下面积(areaundercurve,auc)后进行组间student’st检验而得，**p<0.01；

图7抗生素干预肠道菌群对水迷宫实验的影响；图a为在水迷宫实验中隐蔽平台试验时的逃避潜伏期结果，图b为探索试验时大鼠在每个象限的时间；

图8抗生素干预肠道菌群对旷场实验的影响；图a为大鼠在旷场中心区域停留的时长占总时长的百分比，图b为大鼠在旷场中心区域的路程占总路程的百分比，图c为大鼠在整个旷场区域的行动的路程。

具体实施方式

本发明提供了amuc1100蛋白的用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

本发明以下实施例采用的各种菌种信息如下：

噬粘蛋白艾克曼菌来源(郑州精思威化工有限公司)，其原始来源于(atcc，baa-835)，工作种子批代次为5代。

实施例1

将大鼠随机分为ma暴露组与生理盐水(saline)对照组进行ma诱导的cpp实验。实验流程主要包括适应期(第一天)、预测试(第二天，基线)、训练(第三天到第十二天)和测试(第十三天)。在适应阶段，将大鼠从cpp装置中间箱放入并允许其在cpp装置中自由探索30分钟。预测试时，将大鼠从cpp装置中间箱放入并在cpp装置中自由探索15分钟，停留时间较短的一侧为伴药侧。训练阶段，在奇数天ma暴露组注射甲基苯丙胺(0.5％；2mg/kg，0.4ml/kg，腹腔注射)而生理盐水对照组注射等体积生理盐水放入伴药侧，训练阶段偶数天，两组均注射生理盐水放入非伴药侧。测试当天将大鼠从cpp装置中间箱放入并在cpp装置中自由探索15分钟。测试阶段大鼠在伴药侧的停留时间减去预测试阶段大鼠在伴药侧的停留时间即为cpp值。在预测试和测试结束后留取大鼠粪便进行检测。

与生理盐水对照组相比，经过ma-cpp训练的大鼠在伴药箱停留时间显著性增多，cpp评分显著性高于盐水组，即说明经过ma-cpp训练的大鼠对ma形成了偏爱。然而，经过cpp训练后，即使这些大鼠都注射了相同剂量的ma，大鼠的cpp评分显示出个体差异。在17只ma诱导的cpp大鼠中，我们进一步将cpp得分最高的8只大鼠分入h-cpp组而cpp得分最低的8只大鼠分入l-cpp组(17只大鼠不能平均分为两组，故剔除中间值)。h-cpp组评分明显高于生理盐水组和l-cpp组(h-cpp组与生理盐水组比较，p<0.001；h-cpp组与l-cpp组比较，p<0.001)，而l-cpp组评分与生理盐水组无差异(p＝0.195)，实验流程详见表1，结果如图1。

表1

可见，暴露于同样剂量ma经过cpp训练的大鼠显示出对药物犒赏作用不同程度的偏爱。

比较对ma犒赏作用有不同易感性的大鼠的肠道菌群，我们发现h-cpp组的大鼠中门级verrucomicrobia和科级verrucomicrobiaceae出现显著性升高的相对丰度(p分别为0.038和0.038)。在属级，akk的相对丰度在h-cpp组的大鼠中显著性增高(p＝0.038)。lefse分析进一步证实了上述菌群的显著差异。结果详见图2。

为了检验这些相对丰度有差异的肠道微生物是否反映了大鼠对ma犒赏作用的易感性，我们分析了cpp值与这些差异显著的菌群相对丰度的相关性。我们发现，在ma诱导的cpp训练后，门级verrucomicrobia和科级verrucomicrobiaceae的相对丰度与cpp评分呈正相关(r＝0.601和0.596，p＝0.011和0.012)。在属水平上，acetivibrio的相对丰度与cpp评分呈强负相关(r＝-0.738，p＝0.001)，而与akk(隶属verrucomicrobia门内的verrucomicrobia科)的相对丰度呈正相关(r＝0.596，p＝0.012)。结果详见图3。

经比较对ma犒赏作用有不同易感性的大鼠组间的肠道菌群，可见ma犒赏作用敏感的个体akk的显著增加，且敏感程度和akk相对丰度呈正相关，akk与ma的犒赏作用带来的愉悦记忆密切相关。

实施例2

为探索成瘾物质本身对akk的影响，进一步比较了生理盐水对照组、甲基苯丙胺高低易感性组大鼠在给药处理前后的akk变化后发现，对甲基苯丙胺犒赏作用敏感性低的个体，即未对甲基苯丙胺犒赏作用及其相关环境线索形成明显偏好的大鼠，akk的相对丰度无明显改变，而对甲基苯丙胺犒赏作用敏感性及其相关环境线索记忆能力强的个体与低敏感性个体相比，akk相对丰度显著增加，结果详见图4。

可见，akk相对丰度仅在对精神活性物质犒赏作用敏感性及其相关环境线索记忆能力强的个体中显著增加。

实施例3

大鼠经过广谱抗生素bacitracin70mg/kg,neomycin280mg/kg,vancomycin28mg/kg,pimaricin168ug/kg灌胃每天一次，对照组大鼠灌等量去离子水每天一次，连续灌胃7天后开始ma条件性位置偏爱训练，结果显示经过广谱抗生素处理的大鼠相对于对照组，抗生素组大鼠对ma犒赏作用敏感性显著增加，经广谱抗生素处理后的大鼠肠道菌群多样性显著减少，而akk相对丰度的却显著增加，结果详见图5。

由此可见，抗生素干扰ma成瘾大鼠肠道菌群可使akk相对丰度增加，且对ma犒赏作用敏感性显著增加。

实施例4

抗生素组大鼠经过广谱抗生素bacitracin70mg/kg,neomycin280mg/kg,vancomycin28mg/kg,pimaricin168ug/kg灌胃每天一次，对照组大鼠灌等量去离子水每天一次，连续灌胃7天后抗生素组与对照组均进行ma条件性位置偏爱训练，后继续灌胃至总天数为37天后开始条件性恐惧实验。结果显示抗生素预处理的大鼠，即akk相对丰度的显著增加的大鼠，形成恐惧记忆的情况与对照组无显著差异，但在恐惧记忆的消退过程中呈现出显著性消退加速。结果详见图6。

条件性恐惧实验中，akk相对丰度显著增加的大鼠形成恐惧记忆的情况与对照组无差别，但却在恐惧记忆的消退过程中呈现出消退加速的情况，akk相对丰度显著增加与恐惧记忆的消退密切相关。

实施例5

抗生素预处理组大鼠经过广谱抗生素bacitracin70mg/kg,neomycin280mg/kg,vancomycin28mg/kg,pimaricin168μg/kg灌胃每天一次，对照组大鼠灌等量去离子水每天一次，连续灌胃7天后抗生素组与对照组均进行ma条件性位置偏爱训练，后继续灌胃至总天数为19天后开始水迷宫实验。结果显示抗生素预处理组大鼠与对照组大鼠空间学习记忆能力无明显差别，抗生素对大鼠空间学习记忆能力无影响，结果详见图7。

实施例6

大鼠经过广谱抗生素bacitracin70mg/kg,neomycin280mg/kg,vancomycin28mg/kg,pimaricin168μg/kg灌胃每天一次，对照组大鼠灌等量去离子水每天一次，连续灌胃7天后抗生素组与对照组均进行ma条件性位置偏爱训练，后继续灌胃至总天数为34天后开始旷场实验。结果显示抗生素预处理组大鼠与对照组大鼠基础活动性或焦虑水平无明显差别，表明抗生素对大鼠基础活动性或焦虑水平无影响，结果详见图8。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中南大学湘雅二医院

<120>amuc1100蛋白的用途

<130>mp2007244

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>317

<212>prt

<213>噬粘蛋白艾克曼菌(akkermansiamuciniphila)

<400>1

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151015

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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