专利名称:从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷v的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域：
的提取方法，具体说是一种从罗汉果中制备高
纯度罗汉果苷v的方法。
技术背景
罗汉果，为葫芦科植物罗汉果属多年生草质藤本植物罗汉果 Momordicagrosvenori Swingle的干燥成熟果实，为一常用中药，具有清热解暑、润肺止渴 作用，临床上可用于治疗高血压、肺结核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性支气管炎和急慢性扁 桃体炎等多种疾病。同时罗汉果也是常用饮料干果，提取物是常用甜味剂，大量出口，远销 东南亚、加拿大、美国等地。
罗汉果及罗汉果提取物中的主要成分为葫芦烷型三萜皂苷，包括罗汉果苷 IV(mogroside IV)、罗汉果苷V(mogroside V)、赛门苷I (siamenoside 1)、11_氧_罗汉果 苷V(ll-oxo-mogroside V)、罗汉果苷IIE(mogroside IIE)、罗汉果苷IIlE(mogroside IIIF) 等多种皂苷，其中罗汉果苷V为主要皂苷类成分。罗汉果苷V也是罗汉果的主要活性成分 成分，具有抗肿瘤、降血糖等多种药理作用。罗汉果苷V也是罗汉果的主要甜味成分，其甜 度高，为蔗糖的四百多倍。由于制药工业及食品工业的发展，目前国内外对高纯度的罗汉果 V的需求量非常大，但目前尚未见有高纯度的罗汉果苷V生产、销售。虽有多项专利申请涉 及罗汉果甜苷的提取，方法简单，但所得产物为罗汉果总苷，提取物中罗汉果苷V的纯度均 较低，不超过80X，限制了其应用范围。虽然，但得到的产品中罗汉果苷V的纯度并不高，不 适用于制备95%以上高纯度的罗汉果苷V。
经对现有技术文献的检索发现，公开号为CN1706861A的中国发明专利，于 2005. 12. 14公开的"高纯度罗汉果苷V的制备方法和用途"，其制备过程中醇浸膏用D101 型大孔树脂分离后采用正相硅胶柱层析，然后进一步采用C18柱层析，洗脱液经HPLC检查。 该方法采用大孔树脂除杂，操作较繁琐；反相层析时采用丙酮-水洗脱，有一定毒性；纯度 和收率都有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种从罗汉果中制备高纯度罗汉
果苷V的方法，简化了工艺，具有纯度高、收率高、生产成本低等优点。
本发明通过以下技术方案实现，具体包括如下步骤
(1)先将罗汉果粉碎成粗粉，加入5_10倍的71% _95%的乙醇回流提取211-611，滤 过，回收乙醇得醇浸膏。上述操作可重复1次_2次。
(2)将醇浸膏悬浮于水(水用量为醇浸膏重量5-10倍)，用水饱和的乙酸乙酯萃 取1次-3次，每次乙酸乙酯体积为水溶液体积的0. 5-1. 0倍，回收乙酸乙酯母液，乙酸乙酯
浸膏弃去。
(3)继用水饱和的正丁醇萃取1次_3次上步骤母液，每次正丁醇体积为水溶液体积的0. 5-1. 0倍，回收正丁醇得正丁醇浸膏。
(4)将正丁醇浸膏通过聚酰胺柱(聚酰胺的用量为正丁醇浸膏重量的20-60 倍)，水洗至无罗汉果苷V洗出(检测方法硅胶G薄层检测，展开剂CHClfMe0H-H20 65 : 30 : 5，罗汉果苷V的Rf为0. 4)。水洗液浓縮得粗皂苷。
(5)粗皂苷进行硅胶柱层析(硅胶用量为粗皂苷重量的30-100倍)，氯仿-甲 醇-水洗脱(65 : 30 : 1 65 : 30 : 5)，收集含罗汉果苷V在40X以上的组分(检测 方法高效液相色谱HPLC法，以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(24 : 76)为流动 相；检测波长为210nm，流速1. Oml/min)，合并，回收溶剂，得罗汉果苷v粗品。 (6)取罗汉果苷v粗品进行C18反相硅胶柱层析(反相硅胶用量为罗汉果粗苷v 重量的50-200倍)，水洗，弃去水洗液，20 % 50%乙醇洗脱，收集纯度在95%以上的流分 (检测方法同步骤(5))。合并保留时间相同的组分，回收溶剂，即得纯度大于95%以上的罗 汉果苷V。经IR、MS H-NMR、"C-NMR数据与罗汉果苷V—致，其结构式如下
本发明有益效果通过上述方法分离制备的罗汉果皂V，纯度高，均在95X以上， 且生产成本低。采用乙酸乙酯去除了提取物中大部分脂溶性成分(如脂肪酸、油脂、黄酮、 植物甾醇)，简化了罗汉果皂V的纯化工艺。采用正丁醇从罗汉果抽提罗汉果总苷，避免了 提取物中大量糖分的干扰，同时也避免了用大孔树脂柱层析操作麻烦的缺点；对于提取物 剩余的水溶性黄酮、水溶性色素及鞣质等杂质，通过聚酰胺柱层析方法去除，进一步简化了 工艺。反相柱层析采用稀醇溶液作为流脱剂，简化了工艺，具有纯度高、收率高、生产成本 低。通过综合运用聚酰胺、硅胶、反相硅胶等不同分离原理的介质进行纯化，
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行
实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例1是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
1.罗汉果干果1Kg，加入5L 71X的工业乙醇回流提取2h，滤过，滤液回收乙醇 (可再次用于药材提取)，得醇浸膏94g。[0019]
2.取醇浸膏，加入470mL的水悬浮，然后用235mL水体积的水饱和的乙酸乙酯萃 取，分离乙酸乙酯层，减压回收乙酸乙酯(可再次用于萃取)，得乙酸乙酯浸膏13g。
3.乙酸乙酯萃取后的水溶液继续用水饱和的正丁醇萃取，用量为235mL。分离出 正丁醇，减压回收正丁醇(可再次用于萃取)，得正丁醇浸膏15g。
4.将正丁醇浸膏用水溶解后，通过装有300g 100-200目的聚酰胺柱(柱直径 4. 5cm，干法装柱，湿法上样)，水洗至无罗汉果苷V流出(检测方法硅胶G薄层检测，展开 剂CHCl3-MeOH-H20 65 : 30 : 5，罗汉果苷V的Rf为0. 4)，收集流出液及水洗液。减压收 尽溶剂，得粗皂苷12. 5g。
5.将粗皂苷进行硅胶柱层析(硅胶用量375g， 300-400目；柱直径4. 5cm，干法装 柱，干法上样)，氯仿-甲醇-水(65 : 30 : 1)洗脱，流速5ml/min，每份收集50ml，收集含 罗汉果苷V在40%以上的组分(检测方法高效液相色谱HPLC法，以十八烷基键合硅胶为 填充剂；以乙腈_水24 : 76为流动相；检测波长为210nm，流速1. Oml/min)，合并，减压回 收溶剂，得罗汉果苷v粗品2. 2g。
6.取罗汉果苷v粗品进行反相柱层析，反相硅胶用量110g(硅胶粒径400-600 目；柱直径4. 5cm，湿法装柱，湿法上样)，水洗，弃去水洗液；20 %醇洗，流速2ml/min，每份 收集10ml，对每一流分进行高效液相色谱(HPLC)检测(检测方法同5)，合并保留时间相同 且纯度大于95%的组分，减压浓縮，即得纯度大于95%以上的罗汉果苷V 464mg，经检验其 纯度为96. 7% 。
实施例2
本实施例2是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
1.罗汉果干果1Kg，加入10L 95X的工业乙醇回流提取6h，滤过，滤液回收乙醇
(可再次用于药材提取)，得浸膏。重复上述操作2次，得醇浸膏168g。
2.取醇浸膏，加入1680mL的水悬浮，然后用1680mL的水饱和的乙酸乙酯萃取，分
离乙酸乙酯层，减压回收乙酸乙酯(可再次用于萃取)，得浸膏。重复上述操作2次，合并浸
膏，得乙酸乙酯浸膏21g。
3.乙酸乙酯萃取后的水溶液继续用水饱和的正丁醇萃取，用量为1680mL。分离出 正丁醇，减压回收正丁醇(可再次用于萃取)，得浸膏。重复上述操作2次，合并浸膏，得正 丁醇浸膏29g。
4.将正丁醇浸膏用水溶解后，通过装有1740g的60-100目聚酰胺柱(柱直径 8.0cm，湿法装柱，湿法上样)，水洗至无罗汉果苷V流出(检测方法硅胶G薄层检测，展开 剂CHCl3-MeOH-H20 65 : 30 : 5，罗汉果苷V的Rf为0. 4)，收集流出液及水洗液。减压收 尽溶剂，得粗皂苷21g。
5.将粗皂苷进行硅胶柱层析，硅胶用量为2100g(柱直径8. Ocm， 100-200目；湿法 装柱，湿法上样)，氯仿-甲醇-水(65 : 30 : 5)洗脱，流速10ml/min，每100ml收集l份， 收集含罗汉果苷V在40X以上的组分(检测方法高效液相色谱(HPLC)法，以十八烷基键 合硅胶为填充剂；以乙腈-水24 : 76为流动相；检测波长为210nm，流速1.0ml/min)，合 并，减压回收溶剂，得罗汉果苷v粗品3. 4g。
6.取罗汉果苷v粗品进行反相柱层析，反相硅胶用量为680g(硅胶粒径300-400 目；柱直径6. 5cm，湿法装柱，湿法上样)，水洗，弃去水洗液；50 %醇洗，流速5ml/min，每30ml收集1份，对每一流分进行高效液相色谱(HPLC)检测(检测方法同5)，合并保留时间 相同且纯度大于95%的组分，减压浓縮，即得高纯度的罗汉果苷V 623mg，经检验其纯度为 95. 3%。
实施例3
本实施例3是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
1.罗汉果干果1Kg，加入7. 5L 80%的工业乙醇回流提取4h，滤过，滤液回收乙醇 (可再次用于药材提取)，得浸膏。重复上述操作l次，得醇浸膏133g。
2.取醇浸膏，加入998mL的水悬浮，然后用749mL体积的水饱和的乙酸乙酯萃取， 分离乙酸乙酯层，减压回收乙酸乙酯(可再次用于萃取)，得浸膏。重复上述操作l次，得乙 酸乙酯浸膏18g。
3.乙酸乙酯萃取后的水溶液继续用水饱和的正丁醇萃取，用量为749mL。分离出 正丁醇，回收正丁醇(可再次用于萃取)，重复上述操作1次，合并浸膏得正丁醇浸膏21g。 4.将正丁醇浸膏用水溶解后，通过装有840g 60-100目聚酰胺柱(柱直径6. 5cm， 干法装柱，湿法上样)，水洗至无罗汉果苷V流出(检测方法薄层检测硅胶G薄层检测，展开 剂CHCl3-MeOH-H20(65 : 30 : 5，罗汉果苷V的Rf为0. 4)，收集流出液及水洗液。减压收 尽溶剂，得粗皂苷17g。
5.将粗皂苷进行硅胶柱层析，硅胶200-300目，用量为1105g(柱直径6. 5cm，湿法 装柱，干法上柱)，氯仿-甲醇-水(65 : 30 : 3)洗脱，流速5ml/min，每50ml收集1份， 收集含罗汉果苷V在40X以上的组分(检测方法高效液相色谱(HPLC)法，以十八烷基键 合硅胶为填充剂；以乙腈-水24 : 76为流动相；检测波长为210nm，流速1.0ml/min)，合 并，减压回收溶剂，得罗汉果苷v粗品2. 9g。
6.取罗汉果苷v粗品进行反相柱层析，反相硅胶用量为362.5g(硅胶粒径 200-300目；柱直径6. Ocm，湿法装柱，湿法上样)，水洗，弃去水洗液；35X醇洗，流速3m1/ min，每20ml收集1份，对每一流分进行高效液相色谱(HPLC)检测(检测方法同5)，合并保 留时间相同且纯度大于95X的组分，减压浓縮，即得高纯度的罗汉果苷V 561mg，经检验其 纯度为96. 1%。
实施例4
本实施例4是在以下实施条件和技术要求条件下实施的
1.罗汉果干果1Kg，加入5L 95X的工业乙醇回流提取3h，滤过，滤液回收乙醇 (可再次用于药材提取)，得浸膏。重复上述操作l次，得醇浸膏86g。
2.取醇浸膏，加入860mL的水悬浮，然后用860mL体积的水饱和的乙酸乙酯萃取， 分离乙酸乙酯层，减压回收乙酸乙酯(可再次用于萃取)，得浸膏。重复上述操作l次，得乙 酸乙酯浸膏15g。
3.乙酸乙酯萃取后的水溶液继续用水饱和的正丁醇萃取，用量为430mL。分离出 正丁醇，回收正丁醇(可再次用于萃取)，重复上述操作1次，合并浸膏得正丁醇浸膏20g。 4.将正丁醇浸膏用水溶解后，通过装有960g 60-100目聚酰胺柱(柱直径6. 5cm， 干法装柱，湿法上样)，水洗至无罗汉果苷V流出(检测方法薄层检测硅胶G薄层检测，展开 剂CHCl3-MeOH-H20(65 : 30 : 5，罗汉果苷V的Rf为0. 4)，收集流出液及水洗液。减压收 尽溶剂，得粗皂苷14. 5g。
6[0046] 5.将粗皂苷进行硅胶柱层析，硅胶200-300目，用量为1150g(柱直径6. 5cm，湿法 装柱，干法上柱)，氯仿-甲醇-水(65 : 30 : 3)洗脱，流速5ml/min，每50ml收集1份， 收集含罗汉果苷V在40X以上的组分(检测方法高效液相色谱(HPLC)法，以十八烷基键 合硅胶为填充剂；以乙腈-水24 : 76为流动相；检测波长为210nm，流速1.0ml/min)，合 并，减压回收溶剂，得罗汉果苷v粗品2. 5g。
6.取罗汉果苷v粗品进行反相柱层析，反相硅胶用量为300g(硅胶粒径200-300 目；柱直径6. Ocm，湿法装柱，湿法上样)，水洗，弃去水洗液；40 %醇洗，流速3ml/min，每 20ml收集1份，对每一流分进行高效液相色谱(HPLC)检测(检测方法同5)，合并保留时间 相同且纯度大于95%的组分，减压浓縮，即得高纯度的罗汉果苷V 525mg，经检验其纯度为 97. 1%。
权利要求
一种从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征在于，具体包括如下步骤(1)先将罗汉果粉碎成粗粉，加入5-10倍的70％-95％的乙醇回流提取2h-6h，滤过，回收乙醇得醇浸膏；(2)将醇浸膏悬浮于水，用水饱和的乙酸乙酯萃取1次-3次，每次乙酸乙酯体积为水溶液体积的0.5-1.0倍，回收乙酸乙酯母液；(3)继用水饱和的正丁醇萃取1次-3次上步骤母液，每次正丁醇体积为水溶液体积的0.5-1.0倍，回收正丁醇得正丁醇浸膏；(4)将正丁醇浸膏通过聚酰胺柱，水洗至无罗汉果苷V洗出，水洗液浓缩得粗皂苷；(5)粗皂苷进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水洗脱，收集含罗汉果苷V在40％以上的组分，合并，回收溶剂，得罗汉果苷v粗品；(6)取罗汉果苷v粗品进行C18反相硅胶柱层析，水洗，乙醇洗脱，收集纯度在95％以上的流分，合并保留时间相同的组分，回收溶剂，即得纯度大于95％的罗汉果苷V。
2. 如权利要求
1所述的从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征是，步骤(2) 中所述的醇浸膏悬浮于水，水用量为醇浸膏重量的5-10倍。
3. 如权利要求
1所述的从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征是，步骤(4) 中所述正丁醇浸膏通过聚酰胺柱，聚酰胺的用量为正丁醇浸膏重量的20-60倍。
4. 如权利要求
1所述的从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征是，步骤(4) 中，检测所述水洗至无罗汉果苷V洗出的检测条件为用硅胶G薄层检测，展开剂选用 CHCl3-MeOH-H20，配比是65 : 30 : 5，罗汉果苷V的Rf为0. 4。
5. 如权利要求
1所述的从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征是，步骤(5) 所述的硅胶柱中，硅胶用量为粗皂苷重量的30-100倍；氯仿-甲醇-水洗脱各比例为65 : 30 : 1-65 : 30 : 5。
6. 如权利要求
1所述的从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征是，步骤(5) 中收集含罗汉果苷V在40%以上的组分，其收集检测方法选用高效液相色谱法。
7. 如权利要求
6所述的从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征是，所述高效 液相色谱法的检测条件为以十八烷基键合硅胶为填充剂，以24 : 76比例的乙腈-水为流 动相，检测波长为210nm，流速1. Oml/min。
8. 如权利要求
1所述的从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征是，步骤(6) 中乙醇浓度为20% -50%。
9. 如权利要求
1至8任一项所述的从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，其特征 是，步骤(1)可重复操作1次_2次。
专利摘要
一种从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷V的方法，属于高纯度物质的提取方法。方法步骤为(1)先将罗汉果粉碎成粗粉，加入乙醇回流提取，滤过，得醇浸膏；(2)将醇浸膏悬浮于水，用乙酸乙酯萃取1次-3次，回收乙酸乙酯母液；(3)继用正丁醇萃取1次-3次母液，回收正丁醇得正丁醇浸膏；(4)将正丁醇浸膏通过聚酰胺柱，水洗液浓缩得粗皂苷；(5)粗皂苷进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水洗脱，收集得罗汉果苷v粗品；(6)取罗汉果苷v粗品进行层析，水洗，乙醇洗脱，收集纯度大于95％以上的罗汉果苷V。本发明简化了工艺，具有纯度高、收率高、生产成本低等优点。
文档编号A23L1/236GKCN101029071 B发布类型授权 专利申请号CN 200710039130
公开日2010年5月19日 申请日期2007年4月5日
发明者周兢, 屠鹏飞, 李晓波, 王梦月 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (1),