专利名称:一种检测黄病毒属病毒的codehop rt-pcr试剂及方法
技术领域：
本发明涉及黄病毒的检测技术，具体涉及ー种检测黄病毒属病毒的C0DEH0PRT-PCR试剂及方法。
背景技术：
黄热病毒属病毒(Flavivirus)简称黄病毒,是黄病毒科的最大家族，已知由70多种病毒构成，其中40多种病毒与人类疾病相关，包括登革病毒(DENV)、こ型脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、西尼罗病毒(WNV)、Kujun病毒(KUN)、圣路易斯脑炎病毒和黄热病毒(YFV)等，其中大多数为虫媒病毒。近年来，以登革热病毒、日本脑炎病毒(こ型脑炎病毒)以及西尼罗病毒等为代表的黄病毒疫源地的不断扩大，已成为全球性的公共卫生问题。现有病原体检测技术体系和方法大多为単一病原的常规检测技术，如公开号为CN101629215A的发明专利申请，就公开了检测こ型脑炎病毒、登革病毒和西尼罗病毒 的多重试剂盒，利用各自的特异性引物对上述3种病毒进行检測。也有如授权公告号为CN100557027C的发明专利，公开了检测日本脑炎病毒血清群成员(JEV、WNV、圣路易斯脑炎病毒、KUN和河谷脑炎病毒)的试剂盒和方法，该试剂盒针对也仅是日本脑炎病毒血清群成员的试剂，不能检测出黄热病毒和蜱传脑炎病毒等其它的黄病毒属病毒。C0DEH0P RT-PCR技术是ー种可用于未知病原体检测的新技术，该技术依据病毒家族共有的保守蛋白氨基酸序列，通过专业软件，设计特定引物。当怀疑ー种未知病原体为某病毒或细菌家族的成员，或ー个未知基因是某基因家族成员时，可以用该技术进行验证。目前尚未有应用该技术对黄病毒属病毒群进行检测的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测黄病毒属病毒的C0DEH0P RT-PCR试剂及方法，该检测试剂和方法为黄病毒属病毒通用检测试剂和检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种检测黄病毒属病毒的C0DEH0P RT-PCR试剂，包括10XPCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTP液、Taq酶液、上游引物溶液和下游引物溶液，所述上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntgggayac的引物BI，所述下游引物溶液含有核苷酸序列为TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartcrtcncc的引物B2 ;其中r为嘌呤,可以是g或a, y为喃唳,可以是c或tAi，η是任何碱基，可以是g或a或c或t/u或其它。
利用上述试剂具体检测黄病毒属病毒的方法的步骤如下
a、RNA提取用RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行；
b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒(购于Promega公司)对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板,具体逆转录方法依说明书进行在0.2mL eppendorf管中加入oligo d (T)15primers (50 μ Μ) I μ L，上述约 RNA 10μ L,72°C 10. min，加入 5XRT buffer 4 μ L、dNTP液(IOmM) I μ L、AMV 反转录酶液(IOU/μ L) I μ L、RNA 酶抑制剂(20U/ μ L) O. 5 μ L、无 RNA酶水1.5yL，42°C lh，72°C IOmin ;反应产物即为后续的PCR模板；
c、PCR反应在 O. 2mL 印pendorf 管中加入 10XPCR buffer 2. 5 μ L、浓度为 25mM 的MgCl2溶液L 5 μ L、浓度为IOmM的dNTP液O. 5 μ L、浓度为5U/ μ L的Taq酶液O. 5 μ L、浓度为25 μ M上游引物溶液I μ L、浓度为25 μ M下游引物溶液I μ L，上述PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L组成的反应体系；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s, 720C延伸lmin，45个循环，72°C延伸7min，4°C保存PCR产物，上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物BI，下游引物溶液含有核苷酸序列为 TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc 的引物 B2 ;
d、琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物用重量百分浓度1-1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析，若结果出现42T445bp大小片段的条带,则为黄热属病毒。
以上10XPCR buffer、MgC12、dNTP液、Taq酶液等反应试剂均购自大连宝生生物，
引物由上海生工合成。
上述引物BI、B2是根据Genbank已公布黄热病毒属15种病毒的基因组开放读码框(0RF)编码的多聚蛋白(polyprotein)氨基酸序列设计引物对,包括Kokobera virus,Aroa virus, Ilheus virus, Modoc virus, Spondweni virus, Yellow fever virus 17D/Tiantan,Dengue virus I,Japanese encephalitis virus,Louping ill virus,St. Louisencephalitis virus, Tembusu virus, West Nile virus, Murray Valley encephalitisvirus, Rio Bravo virus, Saumarez Reef virus。将蛋白质氨基酸序列以 FASTA 格式保存，输入http://blocks, fhcrc. org/codehop. html进行Block比对,得到高度保守的连续氨基酸区域。使用CodeHop引物捜索，常规方法筛选合适上下游引物，要求简并度低，上下游引物位置间距在500bp左右。利用primer和oligo软件进行引物分析,得到上述I对杂合寡核苷酸引物(上游引物BI和下游引物B2)，通过序列分析软件与Genbank中获得的42种典型黄热病毒属病毒株全基因比对，理论上均可获得42f445bp的扩增产物。
与现有技术相比，本发明的优点在于适用于检测黄病毒属所有病毒的C0DEH0PRT-PCR的试剂和方法，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，PCR反应中上游弓I物溶液含有序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物BI，下游引物溶液含有序列为TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc的引物B2，引物BI和引物B2是由5'端非兼并共有序列夹和根据保守氨基酸设计的很短的3 '端的核心简并区aggntggga yac或cartc rtcncc组成,扩增产物序列长度为421 445bp ;引物中5 '端非兼并共有序列在不增加引物简并度的情况下能稳定3 '兼并核心区与模板结合作用，允许在较高退火温度下进行，提高了兼并PCR反应的特异性，可以扩增检测黄病毒属内病毒，如こ型脑炎病毒、登革病毒、黄热病病毒、森林脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、圣路易脑炎病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦桑脑炎病毒、蜱传脑炎病毒和科萨努尔森林病病毒等，是ー种黄病毒属通用性检测试剂和方法。可应用于国外流行株传入国内的防控监測，也可应用于与扩展基因同源的未知病毒进行检測，并可以通过对扩增产物的测序可以确定所测病毒的种类或新种发现，所获得的生物信息学数据可以用于黄热属病毒的分子流行病学调查研究。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进ー步详细描述，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例I :用C0DEH0P RT-PCR法检测从蚊虫中分离的こ型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus)
1、总RNA提取从中国检验检疫科学研究院获得的云南省洱源县采集的蚊虫样品中分离，并接种于BHK细胞的こ型脑炎病毒株JEV1201，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA作为阳性RNA (具体提取方法依说明书)。用微量分光光度计测量RNA浓度和纯度，0D260/280彡I. 9，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染，_20°C保存备用；
2、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒对上述阳性RNA进行RNA逆转录，具体方法为在
O.2mL eppendorf管中加入oligo d(T) 15 primers(50 μ Μ) I μ L,阳性RNA 10 μ L, 72°C 10.min,加入 5 X RT buffer 4 μ L、dNTP (IOmM) I μ L、AMV 反转录酶(IOU/ μ L) I μ L、RNA 酶抑制剂(20U/yL)0. 5yL、无RNA酶水1.5yL，42°C lh，72°C IOmin ;反应产物作为后续的PCR模板；
3、PCR反应在 O. 2mL eppendorf 管中加入 10XPCR buffer 2. 5 μ L、MgCl2 溶液(25mM) I. 5 μ し dNTP 液(IOmM)O. 5 μ L、Taq 酶液(5U/ μ L) O. 5 μ L、上游引物溶液(引物 BI浓度为25μΜ) lyL、下游引物溶液(引物Β2浓度为25μΜ) I μ L，PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L组成的反应体系；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72 °C延伸Imin，45个循环，72 °C延伸7min，4°C保存PCR产物；
4、琼脂糖凝胶电泳将PCR产物用浓度1-1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条帯，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析。结果こ型脑炎病毒JEV1201株BHK细胞培养物出现442bp大小片段的条带。
5,C0DEH0P RT-PCR方法灵敏性按照步骤I提取こ型脑炎病毒JEV1201株感染的BHK细胞RNA浓度为347. 6ng/ μ L，将RNA用Rnase-free Water 10倍梯度稀释，按照步骤2-4的方法用B1/B2引物对扩增进行检测，用分光光度计检測。结果显示本检测方法可以检测出的最高稀释度为10_5，相当于34. 76pg核酸的病毒RNA。
6、RT-PCR方法特异性用流行性こ型脑炎JEV1201病毒株RNA、汉坦病毒RNA、甲型HlNl流感病毒RNA、柯萨奇病毒RNA、正常BHK细胞RNA，作为检测对象，按照步骤1_4的方法用B1/B2引物对扩增进行检测，结果只有流行性こ型脑炎JEV1201核酸扩增产物在442bp出现一条特异性条带外，甲型HlNl流感病毒、柯萨奇病毒、汉坦病毒及正常BHK细胞RNA扩增产物均未见特异性核酸条带。
实施例2、用C0DEH0P RT-PCR法检测病人血清中登革热病毒(Dengue virus):从宁波市疾控中心获得的登革热病人血清3份，用RNA提取试剂盒进行血清中总RNA提取(具体提取方法依说明书)，各取10 μ L RNA进行RT-PCR反应；按实施例I的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行RT-PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明3份登革热阳性血清样品均扩增得到433bp大小片段的条带，阴性血清样品对照无相应条带。
实施例3、用C0DEH0P RT-PCR法检测黄热病毒(Yellow fever virus)疫苗获得商品化的黄热病毒疫苗(赛诺菲巴斯德公司)ー份，用RNA提取试剂盒提取总RNA (具体提取方法依说明书)，各取10 μ L RNA提取物进行RT-PCR反应；按实施例I的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行RT-PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明黄热疫苗RNA提取物扩增得到442bp大小片段的条带，空白对照无条带出现。
实施例4、用C0DEH0P RT-PCR法检墨累山谷脑炎病毒(Murray valleyencephalitis virus)疫苗获得商品化的墨累山谷脑炎病毒疫苗(赛诺菲巴斯德公司)一份，用RNA提取试剂盒提取总RNA (具体提取方法依说明书)，各取10 μ L RNA提取物进行RT-PCR反应；按实施例I的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行RT-PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明墨累山谷脑炎病毒疫苗RNA提取物扩增得到 442bp大小片段的条带，空白对照无条带出现。
实施例5、用C0DEH0P RT-PCR法检测波瓦桑脑炎病韋(Powassan encephalitisvirus)疫苗获得商品化的波瓦桑脑炎病毒疫苗(赛诺菲巴斯德公司)ー份，用RNA提取试剂盒提取总RNA (具体提取方法依说明书)，各取IOyL RNA提取物进行RT-PCR反应；按实施例I的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行RT-PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明波瓦桑脑炎病毒疫苗RNA提取物扩增得到433bp大小片段的条带，空白对照无条带出现。
实施例6、用 C0DEH0P RT-PCR 法检测牌传脑炎病韋(Tick-borne encephalitisvirus)疫苗获得商品化的蜱传脑炎病毒疫苗(赛诺菲巴斯德公司)ー份，用RNA提取试剂盒提取总RNA (具体提取方法依说明书)，各取10 μ L RNA提取物进行RT-PCR反应；按实施例I的步骤2进行RNA逆转录，步骤3进行RT-PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明蜱传脑炎病毒疫苗RNA提取物扩增得到433bp大小片段的条带，空白对照无条带出现。
实施例7、用C0DEH0P RT-PCR法检测莫多克病毒(Modoc virus)阳性质粒将人工合成的莫多克病毒核酸片段(宝生物合成)，连接至PMD18-T载体(购自上海生エ)，转化至DH5a大肠杆菌(购自上海生エ)，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒(购自上海生エ)提取质粒作为阳性模板和阴性对照模板；再按实施例I步骤3的方法进行PCR反应，步骤4的方法进行琼脂糖凝胶电泳，结果得到421bp特异性条带，阴性对照无目的条带。
实施例8、用C0DEH0P RT-PCR法检西尼罗河病毒(West Nile virus)阳性质粒人工合成西尼罗河病毒核酸片段(大连宝生生物)，连接至PMD18-T载体，转化至DH5ci大肠杆菌，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒(购自上海生エ)提取质粒作为阳性DNA和阴性DNA。然后按实施例I的步骤3进行PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳,结果阳性质粒DNA出现442bp大小片段的条带，阴性质粒DNA无相应条带出现。
实施例9、用C0DEH0P RT-PCR法检圣路易斯脑炎病毒(St. Louis encephalitisvirus)阳性质粒人工合成圣路易斯脑炎病毒核酸片段(大连宝生生物),连接至pMD18-T载体，转化至DH5 α大肠杆菌，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒作为阳性DNA和阴性DNA，然后按实施例I的步骤3进行PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果阳性质粒DNA出现442bp大小片段的条带，阴性质粒DNA无条带出现。
实施例10、用C0DEH0P RT-PCR法检巴苏跨拉病毒(Bussuquara virus)阳性质粒人工合成巴苏跨拉病毒核酸片段(大连宝生生物)，连接至PMD18-T载体，转化至DH5a大肠杆菌，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒作为阳性DNA和 阴性DNA，然后按实施例I的步骤3进行PCR反应，步骤4进行琼脂糖凝胶电泳，结果阳性质粒DNA出现445bp大小片段的条带，阴性质粒DNA无条带出现。
上述实施例仅是本发明检测黄热病毒属病毒的列举，同理也可以对该黄热病毒属的其他病毒进行检测，可以对扩增产物进行回收纯化，测序后通过基因库比对可以确定所测病毒的基因型别，确定具体黄热病毒属的病毒种类，是ー种适用于所有黄热病毒属病毒种类的检测方法。
权利要求
1.一种检测黄病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂，包括上游引物溶液和下游引物溶液，其特征在于所述上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntgggayac的引物BI，所述下游引物溶液含有核苷酸序列为TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartcrtcncc的引物B2 ;其中r为嘌呤,可以是g或a, y为喃唳,可以是c或tAi，η是任何碱基，可以是g或a或c或t/u或其它。
2.利用权利要求
I所述ー种检测黄病毒属病毒的C0DEH0PRT-PCR试剂检测黄病毒属病毒的方法，其特征在于步骤如下 a、RNA提取用RNA提取试剂盒提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行； b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行，反应产物即为后续的PCR模板； c、PCR反应在O.2mL印pendorf管中加入10XPCR缓冲液2. 5 μ L、浓度为25mM的MgCl2溶液L 5 μ L、浓度为IOmM的dNTP液O. 5 μ L、浓度为5U/ μ L的Taq酶液O. 5 μ L、浓度为25 μ M上游引物溶液I μ L、浓度为25 μ M下游引物溶液I μ L，上述PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L组成的反应体系；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s, 720C延伸lmin，45个循环，72°C延伸7min，4°C保存PCR产物，其中上游引物溶液含有核苷酸序列为AATGTATGCA GATGATACAG Caggntggga yac的引物BI，下游引物溶液含有核苷酸序列为 TCTATCATCA ATTGGTTTAA CAACAcartc rtcncc 的引物 B2 ; d、琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物用重量百分浓度1-1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析，若结果出现42T445bp大小片段的条带,则为黄热属病毒。
专利摘要
本发明公开了一种检测黄病毒属病毒的CODEHOPRT-PCR试剂及方法，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，PCR反应中上游引物溶液含有序列为AATGTATGCAGATGATACAGCaggntgggayac的引物B1，下游引物溶液含有序列为TCTATCATCAATTGGTTTAACAACAcartcrtcncc的引物B2，引物B1和引物B2是由5＇端非兼并共有序列夹和根据保守氨基酸设计的很短的3＇端的核心简并区aggntgggayac或cartcrtcncc组成，扩增产物序列长度为421~445bp；可以扩增检测黄病毒属内病毒，是一种黄病毒属通用性检测试剂和方法。
文档编号C12Q1/68GKCN102643930SQ201210097111
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月5日
发明者倪红霞, 孙肖红, 胡群, 郑剑宁, 韩辉, 马思杰 申请人:中华人民共和国大榭出入境检验检疫局导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan