用前是灭菌的。 CAM启动的细胞分离装置可用于，例如，从置于容器中的样品（28)中分离CAM(30)中的CTC 和/或CEC。CAM(IO)可包括，例如，并入包含细胞粘附材料的层（30)内的玻璃珠（34)。
[0061] CAM启动的细胞分离装置可使用包含测量卡（38)的浸量尺（36)，如图3B中的透 视图和剖视图，测量卡（38)的表面涂覆有CAM膜。浸量尺或测量卡插入到细胞分离容器 (16)中。CAM膜可覆盖在浸量尺（38)表面上和/或试管（16)和/或盖（20)的内壁上。
[0062] 在一个实施方案中，CAM启动的细胞分离装置还包括分离前和/或分离后的部件， 例如过滤器（如Amicon过滤器、中空过滤器）、膜、或帮助在细胞群与CAM膜接触前分离出 细胞群的梯度（gradients)(如水溶性聚鹿糖、鹿糖等）。
[0063] 至于图4,所示的是血液过滤盒（43)的三维视图，该盒包含用于导入要被过滤的 样品的在外壳中的预过滤器（41)，例如筛网（或CAM-涂覆的筛网），塞满CAM(IO)的主要 过滤室（40)，和在外壳中的后过滤器（42)出口。图4B是塞满CAM(IO)的主要过滤室（40) 放大的横断面图。
[0064] 在一个实施方案中，CAM启动的细胞分离装置的CAM膜包含胶原涂覆的微珠，直径 在200-2000微米范围内，成形以产生网格通道使得血液流入膜中。在该血液过滤单元中的 全血可在约37°C下温育，并旋转以模仿血液流动以增加细胞和CAM之间的接触和，以及支 持从血液中有效地富集有活力的细胞。含有诸如肿瘤细胞和内皮祖细胞的靶细胞的血液可 贮藏在CAM-启动的富集装置中持续4-48小时的一段时间，以便增加富集效率。
[0065] 在设计CAM启动的细胞分离装置和系统时需要注意三个参数：（i) CAM组成和试验 表面结构，用以改善对肿瘤血管内微环境的模拟，以便从全血中回收最大数量的有活力的 肿瘤细胞；（ii)部件旋转程序，用以最佳地模仿血液流动，增加肿瘤细胞与CAM之间的接 触，并促进更有效地富集有活力的肿瘤细胞；以及（iii)血液处理方式，用以改善在血样中 肿瘤细胞活力的保留。
[0066] 上述用于富集肿瘤细胞的阳性CTC选择方法也可作为阴性过滤步骤用于收集自 体血液或骨髓，以除去癌细胞。因此，本发明的CAM启动的血液过滤方法可用于癌症手术过 程中进行血液再利用的自体输血、治疗性骨髓移植、外周血干细胞移植和血浆分离置换。所 述的CAM启动的血液过滤装置通过去除循环中能转移的细胞，可用于预防由此产生的癌症 全面扩散。
[0067] 可以进行特异性和灵敏性对照试验以优化试验中肿瘤细胞富集的效率。重要的变 量包括：(a)CAM捕获后外源添加的肿瘤细胞系的活力，（b)最有效富集并分离有活力的肿 瘤细胞的条件，以及（c)导致细胞从CAM膜上完全洗脱的细胞处理方式。 实施例1 来自血液的CTC和CEC
[0068] 可将全血置于CAM血液收集装置中，例如血液收集试管（图2和3)。该试管可在 约37°C下温育，并旋转以模仿血液流动以便增加细胞和CAM之间的接触。可在抗凝血剂存 在下进行血液收集，例如，每mE枸橡酸盐葡萄糖抗凝剂溶液USP (A⑶，Baxter Healthcare Corporation，Deerfield，IL)中添加50单位的肝素锂，以阻止CAM血液测试装置中血液凝 固。密封的CAM-血液试管可置于滚筒中，在约37°C下每分钟旋转5-30转，接着温育1-3小 时用于产生细胞粘附。 实施例2 特异件和灵敏件对照
[0069] 可选择不同肿瘤来源的人肿瘤细胞系用于进行特异性和灵敏性对照试验。例如， 可使用人结肠肿瘤细胞系SW-480、人胃肿瘤细胞系RF-48、几种乳腺肿瘤细胞系、人恶性黑 色素瘤细胞系L0X、以及几种卵巢肿瘤细胞系。肿瘤细胞系可购自美国典型培养物保藏中 心（Manassas，VA)。所有的细胞系应确认对支原体（Mycoplasma)感染是阴性的。对肿瘤细 胞系应检验：(a)平板接种后1小时之内对CAM高亲和力结合；(b)高增殖率；以及（c)在 使用或用表达质粒转化前，肿瘤细胞系应容易且稳定地（100% )用红色或绿色荧光染料进 行荧光标记，所述质粒表达绿色荧光蛋白（GFP)以便能在富集处理结束时直接可见肿瘤细 胞。对照正常血液可用已知的一些绿色荧光标记的或GFP表达性荧光性人肿瘤细胞接种， 并进行CAM细胞富集方法，以评估它们的可比较效率。
[0070] 来自健康供体的全血或来自脐带的脐带血可通过National Disease Research Interchange (Philadelphia)获得。在采血后，血液应马上添加枸橡酸盐葡萄糖抗凝剂溶液 USP (ACD，Baxter Healthcare Corporation，Deerfield，IL)和肝素钮以阻止经常在进一步 试验操作过程中所发生的血液凝固。正常的血液不含有具癌特性的细胞。因此，掺入到这 些血样中的肿瘤细胞应当是在该特异性和灵敏性检测中所唯一回收的。
[0071] 来自健康个体的脐带血或血样可用已知的一些荧光标记的，即荧光染料预标记的 或GFP-标记的肿瘤细胞接种。可将3mL等份量的混合血样转移到CAM测定装置中用于肿 瘤细胞富集。可除去悬浮的血细胞。例如，当I型胶原为支撑CAM膜的骨架时，使用胶原酶 可将CAM捕获的细胞释放到悬浮液中。为了测定来自脐带血的对照有活力的肿瘤细胞的数 量，例如，可掺入约3, 000个GFP-肿瘤细胞到3mL脐带血（约15, 000, 000, 000个血细胞） 或细胞完全培养基（含15%人血清）中并进行CAM富集。回收自培养基的细胞可指示实际 上有活力的肿瘤细胞的数量。（回收自脐带血的细胞数量V(回收自培养基的细胞数目） 的比率表示该测定的效率。与培养基相比，脐带血有活力的肿瘤细胞回收百分数可用于确 定CAM富集测定所用的最佳条件。这些条件包括CAM-血液试管温育一段时间（如，1-3小 时）、旋转速度（如，每分钟5-30转）、以及贮藏血液以保持细胞活力的时间长度（如4-48 小时）。极其大量存在的背景血细胞将阻止癌细胞与CAM表面的直接接触，并减弱CAM方法 的灵敏性。血液收集试管的CAM膜能有利地设计为使得CAM与肿瘤细胞表面接触面积最大 化。细胞温育的时间长度也很重要，因为CAM依赖于肿瘤细胞区别于造血细胞的差异粘附。 实施例3 相对于血液收集试管，在CAM-血液讨滤装詈中测宙细朐活力
[0072] 另一个难题是血样的细胞活力在运送到研宄实验室路程中会改变。增加贮藏时间 预计可能危害血液中细胞。为确定CAM血液装置中的肿瘤细胞在运送过程中是否保持活 力，将3, 000个GFP-肿瘤细胞掺入到3mL脐带血及含有15 %人血清（Sigma)的对照培养 基中。每一等份试样在4°C下贮藏一系列时间（4、6、8、12、16、24、36和48小时）。然后，通 过CAM对每一等份试样进行捕获，并通过CAM测定GFP-肿瘤细胞回收百分率。对每一时间 点，进行4次重复试验，并测定回收百分率。结果显示CAM-捕获的肿瘤细胞活力优于血液 中悬浮的细胞。
[0073] 可使用本领域普通技术人员已知的任何方法对CAM-富集的细胞计数，包括镜检 和流式细胞术（参见如下详细的方法）。对于细胞富集试验而言，通过镜检计数获得的初步 数据表明回收率随掺入剂量而增加，大致依照对数曲线。使用本发明公开的CAM-启动的细 胞分离装置，在原始样品每毫升血液中存在多于1，〇〇〇个GFP-LOX细胞时，可获得约40%的 掺入脐带血中的GFP-LOX人恶性黑色素瘤细胞的回收率，变率约为10%。 伸用流式细朐仪计数并确认患者血液中有活力肿瘤细朐的策略
[0074] 在临床实验室中，可通过多参数流式细胞分析仪测定标记的肿瘤细胞，使用FITC 标记的胶原（绿色）来检测侵袭性肿瘤细胞，使用PE标记的抗-CD45白细胞共同抗原抗体 (红色）来检测并排除白细胞，以及使用7-AAD来排除死亡的细胞。该自动化的细胞分析 可通过使用镜检术进行平行和独立的镜检评估来验证，例如，使用细胞谱系标记，包括抗上 皮、内皮和造血抗原的抗体。
[0075] 可使用多参数流式细胞分析仪通过流式细胞术对血液中侵袭性肿瘤细胞进行计 数，使用了，例如：(a) FITC标记的胶原，其可为肿瘤细胞所摄取（绿色）以检测侵袭性肿 瘤细胞，和（b)PE-标记的抗-CD45白细胞共同抗原抗体（红色），用于检测并排除细胞群 中已污染的白细胞。例如，通过CAM捕获的肿瘤细胞和共分离的正常血细胞可用藻红蛋白 (PE)-缀合的CD45抗体和死亡细胞核酸染料7-AAD后染色。吸出标记的细胞样品并进行分 析，例如，在FACSCalibur流式细胞测定器（Becton Dickinson)上进行分析。除其它因素 之外，用于数据分析的标准可包括：(a)通过前向光散射确定的尺寸，（b)通过正交光散射 确定的粒度，（c)死亡的7-AAD细胞阴性事件，（d) PE-标记的⑶45单克隆抗体（mAb)正常 细胞的阴性事件，以及（e)FITC-肿瘤细胞的阳性事件。
[0076] 本领域技术人员应当明白，存在几种从异源临床标本活细胞中辨别凋亡和死亡细 胞的细胞计量法（例如，使用FITC-标记的膜联蛋白V和碘化丙锭）。例如，为将细胞活力 测试整合入CAM纯化的细胞的多参数流式细胞术中，在固定的CAM细胞群中可使用7-氨 基-放线菌素 D(7_AAD，Molecular Probes)标记死亡细胞。7-AAD可为488nm的氩激光谱 线所激发，并发射远红外光。7-AAD辐射光谱可与FITC和PE辐射所分离（OLIVER等，1999)。 荧光参数容许鉴定CAM纯化的血液细胞亚群中的死亡细胞（7-AAD)、有活力且具侵袭性的 肿瘤细胞（FITC-胶原）以及白细胞（PE-CD45)。新标记的细胞可递送至流式细胞仪分析室 中用于即刻计数或贮藏在悬浮液中，例如，在4°C下贮藏1-3天。可设定FACSCalibur流式 细胞测定器每小时计数2-4个细胞样品。
[0077] 在获得自癌症或心血管疾病患者个体的典型血样中，循环肿瘤和内皮细胞在数量 上大大地超过（在超过100万倍的范围内）正常造血细胞。
[0078] 虽然所述的实施方案并不受限于任何具体假说，但本发明人假定： (a) 在癌症进展最初期，转移性细胞开始出现于原发性肿瘤；这些细胞具有侵袭行为， (b) 作为癌症存在指示的血液肿瘤细胞群能用于早期诊断和进一步的分子分析，以及 (C)存在于循环和原发性肿瘤细胞中基因的诊断性组合可用于：确定循环肿瘤细胞的 组织位置来源、确定特异性癌症亚型、以及高置信度地预测患者的转移潜能。 CAM培养方法富集细朐的镜检特件
[0079] 可平行进行高产量的CAM培养，作为独立的CAM方法，以验证通过CAM富集和流式 细胞仪计数的肿瘤细胞。使用镜检和免疫细胞化学方法可容易地放大该CAM培养方法，上 述镜检和免疫细胞化学方法使用了细胞谱系或推定的肿瘤标记。镜检可用于鉴定通过CAM 富集自血液的CTC，具有如下特征，表示为Co+/Epi+/Endo+/Leu- ;CEC为C〇-/Epi-/Endo+/ Leu-;肿瘤相关