以Gemini表面活性剂反胶束从菠萝皮中萃取分离菠萝蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程中反胶束萃取技术领域，也涉及菠萝皮的回收利用技术。
【背景技术】
[0002] 菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中，它在生物化 工中用于干酪、明胶、水解蛋白的生产，在食品工业中作为一种食品添加剂，使肉质嫩化、啤 酒澄清；在医药工业中，可以治疗水肿及多种炎症，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中 小面积深度烧伤的治疗。
[0003]目前，用于工业化生产、提取菠萝蛋白酶的方法主要有三种：高岭土吸附法、单宁 沉淀法、超滤浓缩法；但这三种方法不仅生产成本高昂、易造成污染环境、生产工艺和操作 复杂，而且所得酶活性也不足以满足医药级别及食品中对酶活性要求较高的应用。且相关 研究多集中于从菠萝茎和果肉中提取菠萝蛋白酶。
[0004] 我国虽然菠萝资源丰富，年产量在140万吨以上，而在用于加工菠萝罐头、果汁 等食品上，采用的完全是菠萝果肉部分，剩下的菠萝皮等部分就被作为废弃物而扔掉，这样 不仅造成了资源的浪费，而且也污染环境。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提出一种充分利用菠萝皮废弃物，以Gemini表面活性剂反胶束 进行高效菠萝蛋白酶提取的方法。
[0006] 本发明包括以下步骤： 1) 制备菠萝蛋白酶粗提液：将干净的菠萝皮与pH值为5. 5?6. 5的磷酸缓冲溶液混 合粉粹后，经渣汁分离，取得粗酶液； 2) 前萃取：将NaCl浓度为0. 05?0. 2M、pH值为8?10. 5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲 液与粗酶液混合后再与反胶束以等体积比混合振荡后，经离心分离取上层有机相；其中，反 胶束由季铵盐Gemini表面活性剂和正己烷、正己醇和水混合组成；所述季铵盐Gemini表面 活性剂在反胶束中的浓度为0. 01g/mL?0. 03g/mL; 3) 后萃取：将KBr浓度为0. 25?1M、pH值为3. 8?4. 2的HAC-NaAC缓冲液与有机 相等体积比混合振荡后，离心分离取下层水相； 4) 冷冻干燥：将下层水相在压强为50±2Pa、温度为-60°C?_55°C下冷冻干燥，得到纯 菠萝蛋白酶。
[0007] 季铵盐Gemini表面活性剂以Cm-s_Cm表示，结构式如下：
【主权项】
1. 以Gemini表面活性剂反胶束从菠萝皮中萃取分离菠萝蛋白酶的方法，包括将干净 的菠萝皮与pH值为5. 5?6. 5的磷酸缓冲溶液混合粉粹后，经渣汁分离，取得粗酶液；将粗 酶液与甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和反胶束混合进行前萃取，再将前萃取取得的上层有机相 与HAC-NaAC缓冲液混合进行后萃取，最后将后萃取取得的下层水相冷冻干燥，得到纯菠萝 蛋白酶；其特征在于： 所述反胶束由季铵盐Gemini表面活性剂和正己烷、正己醇、水混合组成；所述季铵盐 Gemini表面活性剂在反胶束中的浓度为0. Olg/mL?0. 03g/mL ; 所述前萃取是将NaCl浓度为0. 05?0. 2M、pH值为8?10. 5的甘氨酸-氢氧化钠缓 冲液与粗酶液混合后再与反胶束以等体积比混合振荡后，经离心分离取上层有机相； 所述后萃取是将KBr浓度为0. 25?1M、pH值为3. 8?4. 2的HAC-NaAC缓冲液与有 机相等体积比混合振荡后，离心分离取下层水相； 所述冷冻干燥是将下层水相在压强为50±2Pa、温度为-60°C?_55°C下冷冻干燥。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：在反胶束中，正己烷和正己醇的体积比为 6?9. 5:1，水与季铵盐Gemini表面活性剂的摩尔比为10?20:1。
3. 根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述季铵盐Gemini表面活性剂在反胶 束中的浓度为〇. 〇25g/mL?0. 03g/mL。
4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于所述前萃取中，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 和粗酶液的混合体积比为22?25:1。
5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于前萃取时，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中 NaCl的浓度为0. 1M。
6. 根据权利要求1所述方法，其特征在于后萃取时，所述HAC-NaAC缓冲液中KBr的浓 度为0? 25?0? 5M。
【专利摘要】以Gemini表面活性剂反胶束从菠萝皮中萃取分离菠萝蛋白酶的方法，属于生物工程中反胶束萃取技术领域，本发明采用具有季铵盐Gemini表面活性剂的反胶束对菠萝皮中的菠萝蛋白酶进行萃取，萃取过程中仅需少量的表面活性剂，通过控制前萃液的pH值既能使菠萝皮粗提液中的菠萝蛋白酶转移至反胶束，又能减少表面活性剂对菠萝蛋白酶的污染；通过调节正己烷和正己醇的比例，还能提高菠萝蛋白酶的活性。本发明操作过程简单，菠萝蛋白酶活性损失少，酶活性回收率较高，萃取后所得菠萝蛋白酶的活性回收率可达163%，纯化倍数可达到4。
【IPC分类】C12N9-50
【公开号】CN104531642
【申请号】CN201510028564
【发明人】郭霞, 万静, 缪枝彤
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月21日