44] 本发明的有益效果是；
[0045] 该菌体饲料添加剂安全性高。本发明使用的菌种已通过正式安全性评估，其生产 安全性得到保证；本发明在生产过程中未引入对人体安全造成影响的物质。
[0046] 该菌体饲料添加剂中的脂肪酸组成合理，多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量达 到42. 4-45. 8 %，《 -6/ ? -3比为4. 5-5. 3，符合W册和FA0的推荐标准。
[0047] 该菌体饲料添加剂生产所用培养基为廉价葡萄糖和豆稍，二者市场价格较低且容 易获得，因此生产成本低。
[0048] 本发明设及的高山被抱霉Modierella alpina CCFM442已于2014年12月25日 在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中屯、保藏，其保藏号为CGMCC No. 10295。 【【具体实施方式】】
[0049] 通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
[0050] 实施例1 ;生产本发明的菌体饲料添加剂
[0051] 该实施例的实施步骤如下；
[0化2] A、斜面培养
[0化3] 将冷冻保存的高山被抱霉CCFM442菌株挑取一环接种到所述的PDA斜面培养基 上，然后在由上海森信实验仪器有限公司销售的隔水式恒温培养箱（型号；GRP-9080)中在 温度25°C的条件下恒温培养14天，得到所述菌株活化培养物。
[0054] B、种子培养
[0055] 将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到按照说明书所描述方法配制的种子 培养基中，然后在由上海知楚仪器有限公司销售的振荡培养箱（型号；ZQZY-70B)中在温 度25°C与转速2(K)巧m的条件下恒温振荡培养3天，然后称得湿菌体重，将湿菌体与无菌水 按照湿菌体与无菌水质量比1 ;4进行混合，然后用由艾卡仪器设备有限公司销售的分散机 (型号；T10B)对该混合体系进行分散lOmin W制备菌悬液，再按照每升所述菌悬液为lOmL 的接种量接种于所述的种子培养基中，在同一种子培养设备中在温度25°C与转速2(K)巧m 的条件下恒温振荡培养36h，得到高山被抱霉CCFM442种子液。
[0056] C、发酵培养
[0化7] 制备含有50g/L葡萄糖碳源、20g/L豆稍、13. 34g/L硝酸钟、3g/L磯酸氨二钟、Ig/ L硫酸钢、0. 5g/L二水合氯化巧与0. 5g/L六水合氯化儀的混合物水溶液，使用1M硫酸或氨 氧化钟水溶液将其水溶液的抑调节至6. 0,再在温度121°C下灭菌20min，得到所述的发酵 培养基；
[0化引按照W发酵培养基体积计2 %接种量，将步骤B得到的高山被抱霉CCFM442种子液 接种到发酵培养基中，在由New Brunswick公司销售的化发酵罐（型号；BioFlo 115)中 进行发酵培养。首先在温度25°C的条件下培养2天使菌体生物量增至最大，判断依据为发 酵液溶氧量，由于培养初期菌体快速生长需消耗大量氧气，所W发酵液溶氧量逐步下降，下 降至最低点后溶氧量有缓慢升高，该时间点（在温度25°C下培养2天）时菌体生物量最大， 接着在温度6°C的条件下培养5天W促进菌体积累EPA。
[0059] D、后处理
[0060] 使用由Thermo销售的离屯、机（型号；LYNX 4000)，让步骤C得到的含有高山被 抱霉CCFM442的发酵液在转速eOOOrpm的条件下进行离屯、分离，得到的湿菌体使用W湿 菌体体积计4倍蒸馈水洗漆3次，使用同一离屯、机在转速eOOOrpm的条件下离屯、分离，得 到的洗漆沉淀物接着在上海森信实验仪器有限公司销售的电热恒温鼓风干燥箱（型号： DGG-9123A)中在温度50°C与风速2. 3m/s的条件下干燥90min，得到干燥菌体，即所述的菌 体饲料添加剂。
[0061] 采用本说明书描述的的含水率测定参考GB/T 5009.3-2003。粗脂肪测定参 考 GB/T 14772-2008。脂肪酸测定参考文献 Wang LChen W, Feng Y，et al.Genome characterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina.Plos 0ne6:e28319.。
[0062] 本实施例制备得到的干燥菌体（菌体饲料添加剂）的含水率为W干燥菌体总重量 计26. 38%，总脂肪酸含量为10. 56%，其中多不饱和脂肪酸W及《-6系列多不饱和脂肪酸 与《-3系列多不饱和脂肪酸含量列于下表1中。
[0063] 表1 ;菌体饲料添加剂的脂肪酸组成与含量
[0064]
【主权项】
L 一株高山被孢霉（Mortierella alpina)CCFM442,该菌株已于2014年12月25日在 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 10295。
2. 根据权利要求1所述的高山被孢霉CCFM442菌株在生产菌体饲料添加剂中的用途。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于生产菌体饲料添加剂的步骤如下： A、 斜面培养 将冷冻保存的高山被孢霉CCFM442菌株挑取一环接种到PDA斜面培养基上，然后在温 度25°C的条件下恒温培养14天，得到所述菌株活化培养物； B、 种子培养 将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到种子培养基中，然后在温度25°C与200rpm 的条件下恒温振荡培养3天，再称得湿菌体重，将湿菌体与无菌水按照湿菌体与无菌水的 质量比1 :4进行混合，接着用分散机对该混合体系进行分散IOmin以制备菌悬液，再按照每 升所述菌悬液为IOmL接种量接种于所述种子培养基中，在温度25°C与转速200rpm的条件 下恒温振荡培养36h，得到高山被孢霉CCFM442种子液； C、 发酵培养 按照以发酵培养基体积计1% -5%接种量，将步骤B得到的高山被孢霉CCFM442种子 液接种到发酵培养基中；首先在温度25°C的条件下培养2天，接着在温度6°C的条件下培养 5天，得到含有高山被孢霉CCFM442的发酵液。 所述发酵培养基制备方法如下：制备含有50g/L葡萄糖碳源、20g/L豆柏、13. 34g/L硝 酸钾、3g/L磷酸氢二钾、lg/L硫酸钠、0. 5g/L二水合氯化钙与0. 5g/L六水合氯化镁的混合 物水溶液，将其水溶液的PH调节至6. 0,再在温度121 °C下灭菌20min，得到所述的发酵培养 基； D、 后处理 让步骤C得到的含有高山被孢霉CCFM442的发酵液进行离心分离，得到的湿菌体用蒸 馏水进行洗涤，再离心分离，洗涤湿菌体接着干燥，于是得到一种干燥菌体，即所述的菌体 饲料添加剂。
4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤C中，所述水溶液的pH是使用硫酸 及氢氧化钾水溶液调节的。
5. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤D中，所述的离心分离是在转速 6000rpm的条件下进行离心分离lOmin。
6. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤D中，所述的洗涤是使用以湿菌体体 积计3-5倍蒸馏水洗涤2-4次。
7. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤D中，所述的干燥是在温度48-52? 与风速2. 1-2. 5m/s是条件下干燥85_95min。
8. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于在步骤D中，所述干燥菌体的含水率为以干 燥菌体总重量计25. 4-26. 4%，总脂肪酸含量为7. 6-10. 7%，其中多不饱和脂肪酸在总脂 肪酸中的含量是42. 4-45. 8 %。
9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于在所述的多不饱和脂肪酸中，ω-6系列多 不饱和脂肪酸与ω-3系列多不饱和脂肪酸的比为4. 5-5. 3。
10.根据权利要求3-9中任一项权利要求所述的用途，其特征在于所述的菌体饲料添 加剂的用量是基础饲料总重量的5-10。
【专利摘要】本发明涉及一种高山被孢霉CCFM442菌株及其用途。本发明利用高山被孢霉CCFM442菌株生产菌体饲料添加剂，该生产菌体饲料添加剂的方法包括斜面培养、种子培养、发酵培养以及后处理步骤。该菌体饲料添加剂安全性高。该菌体饲料添加剂中的脂肪酸组成合理，多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的含量达到42.4-45.8％，ω-6/ω-3比为4.5-5.3，符合WHO和FAO的推荐标准。该菌体饲料添加剂生产所用培养基为廉价葡萄糖和豆粕，二者市场价格较低且容易获得，因此生产成本低。CGMCC No.1029520141225
【IPC分类】C12N1-14, A23K1-16, C12R1-645
【公开号】CN104630077
【申请号】CN201510062057
【发明人】陈永泉, 陈海琴, 陈卫, 代鹏, 王鸿超, 杨芹, 赵建新, 顾震南, 张灏
【申请人】江南大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月5日