2. 3软件分析结果，Ct为每个反应管内 的英光信号到达设定的阔值时所经历的循环数，采用比较Ct值法计算样本中GRP78 mRNA 相对表达量；计算2'（- A Ct)值表示样品中目的基因初始mRNA相对表达量，A Ct是同一 个样本中目的基因Ct值减去内参Ct值；按2' (- A Ct)换算成基因表达量；W样本2的 2'（- A Ct)值校正为1作为参照，计算出目的基因的相对表达量；使用SPSS19. 0统计软件， 计数数据W均数+标准差。=0:表示；W户< 0. 05为差异有统计学意义，W户< 0. 01为 差异有显著统计学意义。
[0017] 本发明上述方法不属于专利法25条第3款规定的疾病的诊断与治疗方法。原因 如下；其一，该方法在体外实施；其二，根据该方法得出的结果，无论好坏都不能直接作为 判断疾病与否的指标，该结果只能用于评估特定人群(糖尿病患者，尤其是2型糖尿病患者） 将来患结直肠癌的可能性，W及对其当前健康状况的评估，有助于糖尿病并发结直肠癌的 早期预警、早诊早治、预后评估。
[0018] 目前国内外尚未见关于高血糖状态并发结直肠癌的特异性分子标志物的报道。
[0019] 本研究组收集了 391名结直肠癌患者的初入院空腹血糖值，统计不同血糖水平结 直肠癌患者所占百分比，并析不同血糖水平与临床病理参数的相关性。我们发现，高血糖并 发的结直肠癌患者高达29. 67%，高血糖并发结直肠癌的患者肿瘤直径更大、分化程度更差， 提示血糖水平可明显影响结直肠癌患者的肿瘤恶性程度及进展程度。
[0020] 本研究组采用Illumina Hiseq第二代测序平台对并发及不并发高血糖的结直肠 癌肿瘤组织及正常肠组织样本分别进行了高通量转录组测序，通过信息学分析后，初步筛 选了一批在糖尿病并发结直肠癌组织中表达量具有显著差异的分子标志物。为进一步验 证上述筛选的分子标志物对于高血糖并发结直肠癌病程及预后评估的可靠性，我们收集了 120例结直肠癌患者肿瘤、正常组织及血清样本，收集了 120例糖尿病患者血清样本，检测 上述两类患者初入院时清晨空腹血糖水平，根据血糖水平及良恶性分类后，进一步采用实 时定量PCR法验证了上述两类患者相关样本中特异性分子标志物的mRNA水平。
[0021] 我们的验证结果发现，葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)在并发高血糖的结直肠癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于并发高血糖结直肠 癌患者的正常肠组织，在正常血糖的结直肠癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于正常血 糖的结直肠癌患者正常肠组织。而在正常肠粘膜细胞及健康人群外周血中不表达或低表 达。我们认为GRP78在高血糖状态下并发结直肠癌的发生发展中具有较高的特异性及灵敏 性，可W作为糖尿病并发结直肠癌的标志物之一。
[0022] 葡萄糖调节蛋白 78 (glucose-regulated protein 78，GRP78),也称热休克 70kDa 蛋白化eat shock 70kDa protein 5，服PA5)、免疫球蛋白重链结合蛋白，是定位于内质网 上的热休克蛋白70家族成员，具有保守的AWase结构域和多肤结合结构域。作为内质网 主要分子伴侣之一，GRP78可W促进蛋白质在内质网中的正确折叠与组装，阻止错误折叠 蛋白的蓄积，祀向降解错误折叠的蛋白，从而维持内质网内环境的稳定。GRP78也是内质网 应激的标志性分子之一，而内质网应激是引起糖尿病及慢性并发症发生发展的关键机制之 一。GRP78主要参与阻止内质网新生肤聚集、调节内质网巧稳态、抗内质网相关性细胞调亡 W及启动未折叠蛋白反应等细胞生命过程。近年相关研究发现GRP78与基因的表达水平异 常及糖尿病慢性并发症的发生、发展密切相关。GRP78参与糖尿病性动脉粥样硬化、糖尿病 肾病、糖尿病脑病等多种慢性并发症的病理过程。
[0023] 由于肿瘤细胞的糖代谢加速，糖降解活性增加，实体肿瘤生长速度加快等因素，导 致内质网中的低糖环境及错误折叠蛋白质的积聚，激发未折叠蛋白反应。适应未折叠蛋白 反应的一种重要反应是诱导内质网中分子伴侣GRP78的表达，有研究证实GRP78的表达是 肿瘤发生发展的主要生存因子，且GRP78在多种肿瘤组织中表达增高。研究显示，在正常结 肠组织、结肠良性增生组织及癌组织中，GRP78的表达呈现逐渐增高的趋势，表明GRP78在 结肠癌的发生中起一定的作用，提示它不仅可W作为一种标志物指示结肠癌的发生，也可 W作为其治疗的祀点。
[0024] 综上所述，本发明的有益效果是： 1、 本发明产品将通过检测高血糖状态人群外周静脉血清样本中GRP78 mRNA表达水 平，可用于评估高血糖人群并发结直肠癌的易感性及预后，有助于糖尿病并发结直肠癌患 者的早期预警、早诊早治、预后评估，对于降低我国糖尿病、结直肠癌的高发病率、高致死率 具有重大的应用价值； 2、 本发明建立了利用特异性引物检测外周静脉血清GRP78 mRNA的方法；由于本方法 采用了定量PCR扩增技术，使得检测GRP78 mRNA的敏感性大大提高，能保证在极少的标本 中获得足够的信息； 3、 本发明还提供了作为阳性对照(标准品)的含有高表达GRP78基因的cDNA模板(体积 2y L);标准品碱基序列为；AACCCCGAGAACACGGTCTTTGACGCCAAGCGGCTCATCGGCCGCACGTGGAAT GACCCGTCTGTGCAGCAGGACATCAAGTTCTTGCCGTTCAAGGTGGTTGAAAAGAAAACTAAACCATACATTCAAGT TGATATTGGAGGTGGGCAAACAAAGACATTTGCTCCTGAAGAAATTTCTGCCATGGTTCTCACTAAAATGAAAGAAA CCGCTGAGGCTTATTTGGGAAAGAAGGTTACCCATGCAGTTGT ； 4、 本发明还提供了作为阴性对照的不表达或低表达GRP78基因的cDNA模板(体积 2 y L)。
【附图说明】
[0025] 图1显示的是本发明血清样本提取总RNA琼脂糖凝胶电泳； 图2显示的是本发明Agilent 2100芯片检测样本1的RNA样品完整性； 图3显示的是本发明Agilent 2100芯片检测样本2的RNA样品完整性； 图4显示的是本发明GRP78 mRNA扩增动力学曲线； 图5显示的是本发明GAPDH mRNA扩增动力学曲线； 图6显示的是本发明GRP78 mRNA的相对表达量。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明进一步说明。但应明确，本文上述说明W及下述实施例 仅是用作举例说明，并不构成对本发明范围的限制。
[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[002引 1.引物设计和合成 1. 1 GRP78基因引物设计与合成 拟扩增的GRP78基因标准品序列为GRP78基因第6外显子区1282-1456碱 基，WGRP78全长mRNA序列为模板设计引物。标准品PCR上游引物F序列为；5'-CCCGTCCAGAAAGTGTTG -3,；下游引物 R 序列为；5, - CAGCACCATACGCTACAG -3，。
[0030] 1. 2 GAPDH基因引物设计与合成 拟扩增的内参照基因人类甘油酵-3-磯酸脱氨酶（GAPDH)序列为GAPDH基因第6、7外 显子区1065-1174碱基，W GAPDH长mRNA序列为模板设计引物，GAPDH基因上游引物F序列 为；5' -CACCCAC TCCTCCACCTTTG-3' ；下游引物 R 序列为；5' - CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。
[0031] 2.含有高表达GRP78基因的cDNA模板、不表达或低表达GRP78基因的cDNA模板 制备方法 2. 1有关试剂的配制： (1) DEPC水配制方法： 在1000血的双重蒸觸水（dd&O)中加入ImLDEPC原液，磁力揽拌器揽拌过夜。
[0032] (2) 1 mol/L Tris.CKpH =8. 0)配制方法；800 血蒸觸水中溶解 121. 1 g Tris， 加浓肥1调抑至8. 0,定容至1 L，高压灭菌备用。
[0033] (3) 50XTAE缓冲液配制方法；500血双蒸水中溶解242 g Tris，加入100血0. 5 mol/L邸TA (pH =8. 0)、57. 1血冰己酸，定容至1 L，室温保存备用。
[0034] 2. 2血清总RNA的提取 (1) W邸TA-K2抗凝真空负压采血管收集特定人群1、特定人群2的清晨空腹外周静脉 血各5ml (分别为样本1、样本2)，置于冷冻离也机中，4°C下调整转速2500-3000 r/min，离 也8-lOmin后用无菌吸管吸取血清2 ml~3ml ; (注：特定人群1 :高血糖并发结直肠患者：该类患者在未使用降糖药的情况下年平 均空腹血糖水平八.77mmol/L、肿瘤组织在手术切除后经病理科确诊为结直肠癌；特定人 群2 ;糖尿病(未并发肿瘤病）患者；该患者在未使用降糖药的情况下月平均空腹血糖水平 〉7. 77mmol/L、经超声影像学/肠镜活检病理检查无结直肠肿瘤者） (2) 将上述血清加入含有ImL Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰 上； (3) 置于超净台中，温育5min, 12000r/min，离也lOmin ; (4) 吸上清于新的1.5血离也管中，加入200yL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4°C， 12000;r/mi