均设置相对应的螺纹8，能够使二者的连接更加紧固，所述内管密封盖7内设置密封胶垫9，进一步保证离心内管I的密封性。所述离心内管I的外侧套接有胶皮垫圈10，所述胶皮垫圈10紧密贴附于离心内管I的外壁上且能够调整与离心内管I的相对高度。当离心内管I插入离心管2并靠近离心管2底部后，通过调整所述胶皮垫圈10在离心内管I上的位置，使胶皮垫圈10担托于离心管2管壁顶端，从而使离心内管I与离心管2的相对位置固定。所述离心内管1、滤纸支架4、滤纸压环6均由医用聚丙烯制成。医用聚丙烯具有比重小、造价低、耐高温、易加工、透明度高、表面光滑、卫生等优点。
[0051]利用上述一种精子分离装置实施的一种双管真空薄膜精子分离法，具体操作步骤如下:
[0052](I)实验采用Vitrolife瑞典公司的产品:SpermGrad精子梯度分离液(用于精子梯度分离，是碳酸氢盐和HEPES缓冲系统，硅烷包被的胶质二氧化硅颗粒，)和SpermRinse精子洗液(是HEPES缓冲培养液，包含用于保证精子活力的糖类和抗生素。用于洗精、上游、稀释SpermGrad，)，处理精子前将精子洗液SpermRinse和密度梯度溶液SpermGrad放置37°C。用精子洗液将密度梯度溶液稀释配成92%和46%两种密度梯度溶液，用5ml巴士德吸管吸取46%密度梯度溶液1.5毫升置于1ml离心管2底部，再吸取92%密度梯度溶液1.5毫升，小心将吸管插入1ml离心管2底部，缓慢将92%密度梯度溶液加到离心管2底部，46%密度梯度溶液会浮在上层，保证两者之间的界面清晰。(此步骤为经典密度梯度分离精子方法中密度梯度溶液准备过程)。
[0053](2)将离心内管I缓慢插入上述盛有密度梯度离心溶液的1ml离心管2中至距底部3mm处，使离心内管I的底端与离心管2底部内壁有微小距离，此操作需缓慢轻柔，保证不破坏密度梯度溶液的界面。调整离心内管I外侧的胶皮垫圈10，使其撑在离心外管上。
[0054](3)滴加0.3ml精子洗液至离心内管I使离心内管I内的滤纸5湿润。
[0055](4)将刚取出的精液在37°C温度下放置15分钟，液化精液或不液化精液均可采用此方法分离处理。将精液缓缓滴加在离心内管I的过滤装置3的滤膜上，注意不要接触到滤纸5以免戳破。
[0056](5)旋紧离心内管I上的密封盖保证离心内管I管内的密封。
[0057](6)将插有离心内管I的离心管2进行2500rpm离心15min。离心处理使精液无论液化与否均可通过过滤装置3实现液化，并融于离心内管I底部的密度梯度溶液，从而使离心内管I内产生一定的负压，并且由于离心沉降分层使得精液中的杂质、有害物质等溶于离心内管I内的46%密度梯度溶液。轻轻取出离心内管1，将所述离心内管I自离心管2内取出时，所述离心内管I内的负压能够将离心内管I里的46%密度梯度溶液和部分92%密度梯度溶液一同吸出，离心内管I里的部分92%密度梯度溶液以及底部的精子团则落到离心管2底部。这样一来精液中的杂质和有害物质也被一并去除，所有的除活动精子外的上层所有细胞、颗粒均分离出去，从而达到分离精子的目的。与传统的密度离心法不同的是不会因吸管抽吸分离精子的过程带入部分的上层杂质进入已分离的精子内，使精浆物质彻底与精子分1?。
[0058](7)将所述离心管2内的剩余物质使用4ml精子洗液混匀后，进行2500rpm离心6min，可将多余92%的密度梯度溶液去除，剩余所需分离的活动精子，可用于人工授精或其他研宄。
[0059]所有步骤使用器材、精子洗液、密度梯度溶液均为无菌一次性使用耗材、试剂。
[0060]通过应用本发明装置离心内管I进行如上操作，可以将精液的液化和精子的分离同步进行，无论精液液化与否，均可直接进行试验操作，而无需进行添加培养液、蛋白酶及进行吹打等对精子有所损害的操作环节，使精子的收率大大提高。且离心内管I自身产生负压吸取代替了传统离心处理后的手动吸取，在保留传统密度梯度离心法的高回收率的同时，使精浆物质彻底与精子分离，保证了分理处的精子的质量。
【主权项】
1.一种精子分离装置，其特征在于:包括离心内管(I)和离心管(2)，所述离心内管(I)置于离心管(2)内，所述离心内管(I)的下部为尖端开口的锥体结构，所述离心内管(I)的内部设置过滤装置(3)，所述过滤装置(3)位于离心内管(I)的管内中部，并包括有滤纸支架(4)、滤纸(5)和滤纸压环(6)，所述滤纸支架(4)为网孔结构，所述滤纸(5)为若干层且设置于滤纸支架(4)上，所述滤纸(5)为孔径30?50微米的中速定性滤纸，所述滤压环(6)设置在滤纸(5)上，所述离心内管顶部的管口处设置内管密封盖(7)。
2.根据权利要求1所述精子分离装置，其特征在于:所述离心内管(I)的顶端与内管密封盖(7)的连接处均设置相对应的螺纹(8)，所述内管密封盖(7)内设置密封胶垫(9)。
3.根据权利要求1所述精子分离装置，其特征在于:所述离心内管(I)的外侧裹套有胶皮垫圈(10)。
4.根据权利要求1所述精子分离装置，其特征在于:所述离心管(2)的规格是10-15ml的离心管⑵。
5.利用权利要求1?4中任一项所述一种精子分离装置实施的一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于:包括以下步骤: (a)用精子洗液将密度梯度溶液稀释配成α%和β %两种密度梯度溶液，所述α的数值大于β的数值，将等量的α %和β %两种密度梯度溶液分层置于离心管(2)底部，并使所述α %密度梯度溶液位于β %密度梯度溶液的下方且两者之间界面清晰； (b)将所述离心内管(I)插入由步骤(a)备好的离心管(2)底部，确保不破坏密度梯度溶液界面的清晰，并使所述离心内管(I)与离心管(2)的相对位置固定； (C)将精子洗液滴入离心内管(I)使过滤装置(3)湿润； (d)将精液滴加在离心内管⑴的过滤装置(3)上； (e)闭合内管密封盖(7)将离心内管(I)的管口密封； (f)将离心管(2)及离心内管(I)进行低速离心处理后，取出离心内管(I)使其与离心管(2)分离，离心管(2)的剩余物质即为部分α %密度梯度溶液以及底部的精子团； (g)离心管(2)剩余物质经精子洗液混匀低速离心洗涤后即为分离的活动精子。
6.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于:所述α%的数值为90%，所述0%的数值为45%。
7.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于:所述步骤(a)中，α %和β %两种密度梯度溶液的用量均为0.8-1.5ml，所述步骤(C)中精子洗液的用量为0.1—0.3ml。
8.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于:所述步骤(f)中的低速离心操作为，将离心管⑵及离心内管⑴进行2500rpm离心10_15min。
9.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于:所述步骤(g)中的精子洗液用量为3-6ml，低速离心操作为将离心管进行2500rpm离心5_10min。
10.根据权利要求5所述一种双管真空薄膜精子分离法，其特征在于:将步骤(a)中的精子洗液和密度梯度溶液在进行操作前放置于37°C条件下，步骤(d)中的精液取出后在37°C温度下放置1min再进行滴加操作。
【专利摘要】本发明公开了一种双管真空薄膜精子分离法及装置，主要涉及细胞生物学领域。包括离心内管和离心管，所述离心内管的下部为尖端开口的锥体结构，所述离心内管的内部设置过滤装置，所述离心内管顶部的管口处设置内管密封盖。使用本装置对精液进行分离操作时，采用经典密度梯度精子分离法进行密度梯度溶液的准备，并将精子洗液及精子依次滴加在过滤装置上，经过低速离心处理后，取出离心内管使其与离心管分离，离心管的剩余物质即为部分α％密度梯度溶液以及底部的精子团。本发明的有益效果在于：无论精液是否液化，都能够通过简易操作，将精浆与精子彻底分离。避免了精液的预处理过程中对精子的伤害，成功率、回收率和精子质量俱佳。
【IPC分类】C12M1-24, C12N5-076
【公开号】CN104651224
【申请号】CN201510069699
【发明人】张丽红, 杨慧, 吕淑君, 王秋菊, 赵俭, 张艳萍, 张伟, 董云玲, 宋霞
【申请人】张丽红
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月10日