细胞用PBS缓冲液重复洗涤，加适量10 %FCSRPMI1640悬浮 细胞，计数并用培养液调节细胞密度为2X105个ml。细胞毒活性检测：接种靶细胞A549， 按每孔2X104个/ 100ul，于96孔平底细胞培养板中培养4h上，按效靶比10 : 1、5 : 1、 2. 5 : 1和1. 25 : 1分别加入96孔板中，经效应细胞培养液在37°C、5%C02条件下常规 培养过夜，加入MTT液，最后测A570值。计算杀伤率：杀伤率=1-[(靶效细胞总数-效应 细胞）/靶细胞]X 100%。
[0013] ③存活率。将DCIK细胞制成1.0 X106个/ ml细胞悬液，取0.2ml细胞悬液并加 入0. 5ml台盼蓝溶液和0. 3ml PBS，充分混匀静置5-15分钟。混匀细胞并用血细胞计数于 普通显微镜下观察计数：正常细胞不被染色，细胞死亡后细胞膜通透性增大，台盼蓝进入细 胞内，故细胞呈蓝色。细胞活力（％ )=(总细胞数-着色细胞数）+总细胞数X 100%。
[0014] ④细胞纯度。适量的PBS缓冲液重悬DC或CIK细胞并调整细胞浓度为2 X 107个/ ml。采用直接标记的一抗，以⑶la+⑶80双标记法检测DC细胞，以⑶3+⑶56双标记法检测 CIK细胞（抗体加入浓度为0. 5-lug / 106细胞）。抗体加入后冰上孵育5-10分钟，加入 缓冲液4°C下300-400g离心5分钟，并弃去上清，重复洗涤3次。用500ul缓冲液重悬细胞 后上机检测，操作尽量保持在避光和4°C左右的温度下进行。双阳性细胞数占总细胞数的百 分比即为DC细胞或CIK细胞纯度。
[0015] (5)细胞移植。临近移植前做革兰氏染色，并与亚健康者签署知情者同意书，并按 照康复计划将质检合格的DCIK细胞在无菌条件下静脉输注亚健康者本人，100ml生理盐水 含DC细胞和CIK细胞分别为IX 107和IX 109于静脉内注射。细胞输注时间是抽血后2周、 3周、5周、8周、12周。细胞注射后的安全性观察：发热、失眠、厌食和发疹等。剩余细胞用 自体血浆或血清（90% )加DMS0(10% )液氮冻存备用。
[0016] (6)随访及康复方案调整。细胞移植后对亚健康者进行健康访问、复查，并根据康 复结果调整康复计划。
【主权项】
1. 一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征在于： (1) 亚健康人群筛选，入选者年龄35-55岁成年男女，没有重大疾病，身体状况稳定。参 与者进行健康问卷、自评、问诊、一级检查和二级检查。 (2) 自体免疫细胞的采集。无菌条件下取得亚健康者静脉抗凝血，4°C并运至GMP车间。 ⑶自体免疫细胞CIK和DC在GMP车间培养诱导。在百级GMP车间条件下，采用Ficol 1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，将分离得到的单个核细胞接种于PRMI1640培养 基，并添加细胞因子培养。转移细胞培养上清液（粘附细胞供DC细胞诱导扩增所用）至另 一经anti-⑶3单抗包被的培养瓶培养，此为CIK细胞。未转移的粘附细胞用PRMI1640培 养基继续培养并添加 GM-CSF、IL-4及自体血清等培养，此为DC细胞。DC和CIK细胞按照 一定比例共培养，并细胞表面分子的表达进行检测。 (4) 免疫细胞制剂的质量控制。细胞培养完成或培养过程中进行各项指标的检测，这些 指标包括：无菌实验（包括细菌、内毒素和支原体）、生物活性检测、存活率、细胞纯度及细 胞鉴定。 (5) 细胞移植。临近移植前做革兰氏染色，签署细胞输注知情者同意书，按照康复计划 将质检合格的DCIK细胞在无菌条件下静脉输注亚健康者本人。 (6) 随访及康复方案调整。细胞移植后对亚健康者进行健康访问、复查，并根据康复结 果调整康复计划。
2. 根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步 序（1)亚健康人群筛选，入选者年龄35-55岁成年男女，没有重大疾病，身体状况稳定。参与 者进行健康问卷、自评、问诊、一级检查和二级检查。评价结果符合亚健康标准即疲劳（休 息不能缓解的疲劳；往常从事的活动下降50% )加任意6项次要症状（①畏寒、低热，②咽 喉不适，③淋巴结肿大，④不能解释的全身无力感，⑤肌肉酸痛，⑥头痛，⑦日常活动后疲劳 感不能回复，⑧关节疼痛，⑨睡眠紊乱，⑩精神、神经症状；急性、亚急性出现）和任意2条体 征（①颈淋巴结肿大< 2cm，②低热，②咽喉炎），或者疲劳加任意8项次要症状。自我评价 大于等于50分。一般身体检查正常，二级检查包括免疫细胞分类、免疫细胞功能、免疫分子 和SOD检测有三项以上阳性或者高于/低于正常值。
3. 根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步 序（2)自体免疫细胞的采集。无菌条件下静脉抽取亚健康者外周血50毫升，肝素（20U / mL)抗凝，混匀并填写样本信息表，在4。°C无菌环境下运至100级G M P车间加工。
4. 根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步 序（3)自体免疫细胞在GMP车间培养诱导。在百级G M P车间条件下，采用Ficoll密度梯 度离心法分离外周血单个核细胞，将分离得到的单个核细胞按照细胞浓度为5X105 / ml接 种于PRMI1640 培养基，添加 1000 u / ml of IFN-gama、100u / ml of IL-la、500u / ml of IL-2细胞因子、IOOu / ml青霉素 、IOOu / ml链霉素 ，I %自体血清，常规培养24小时。转 移细胞培养上清液（粘附细胞供DC细胞诱导扩增所用）至另一经5ug / ml of anti-⑶3 单抗包被的培养瓶，常规培养7天，此为CIK (cytokine induced killer,细胞因子诱导的 杀伤细胞）细胞。未转移的粘附细胞用PRMI1640培养基继续培养并添加 1000 u / ml of GM_CSF、500u / ml of IL-4及2%的自体血清等培养7天，此为DC(dendritic cells，树突 状细胞）细胞。将培养7天的DC和CIK细胞以I :3比例混合，培养液为上述CIK细胞培养 液，常规培养7天，检测粘附细胞DC细胞表达⑶80、⑶40、MHC-DR、IL-12水平及非粘附细 胞CIK表达⑶28、⑶40和⑶40L的表达水平。
5. 根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步 序（4)免疫细胞制剂的质量控制。细胞培养诱导完成或培养过程中进行各项指标的检测， 这些指标包括：①微生物检测包括无菌检测、内毒素检测和支原体检测。参照药典2010版 附录XII A无菌检测法或用BD公司的血细菌培养瓶，取细胞培养上清液3-5ml于BD血细 菌培养瓶，置于细菌培养仪培养2周后观察结果；内毒素检测，参照药典2010版附录XII E 细菌内毒素检查法，内毒素限值的确定按照相关说明计算；支原体检测，参照药典2010版 附录XII B支原体检查法，结果应为无支原体生长。②生物活性检测。效应细胞DCIK体外 生物活性分析（以同源CIK细胞、DC细胞作为对照），将诱导培养的DCIK细胞密度调整为 4X10 6个/ ml、2X106、lX106和0.5X106个/ ml。靶细胞A549用胰蛋白酶消化液处理、 离心后，取悬浮细胞用PBS缓冲液重复洗涤，加适量10% FCS RPMI1640悬浮细胞，计数并用 培养液调节细胞密度为2 X IO5个ml。在上述靶细胞中加入效应细胞培养过夜，用MTT法检 测同时以CIK细胞和DC细胞作对照。③存活率：将DCIK细胞制成1.0 X IO6个/ ml细胞 悬液，取0. 2ml细胞悬液并加入0. 5ml台酚蓝溶液和0. 3ml PBS，充分混匀静置5-15分钟。 混匀细胞并用血细胞计数于普通显微镜下观察计数，细胞活力（％) =(总细胞数-着色 细胞数）+总细胞数X 100%。④细胞纯度：适量的PBS缓冲液重悬DC或CIK细胞并调整 细胞浓度为2 X IO7个/ ml。采用直接标记的一抗，以⑶Ia+⑶80双标记法检测DC细胞，以 ⑶3+⑶56双标记法检测CIK细胞（抗体加入浓度为0. 5-lug / IO6细胞）。抗体加入后冰 上孵育5-10分钟，加入缓冲液重复洗涤3次后上机检测，双阳性细胞数占总细胞数的百分 比即为DC细胞或CIK细胞纯度。
6. 根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步 序（5)细胞移植。临近移植前做革兰氏染色，并与亚健康者签署知情者同意书，并按照康复 计划将质检合格的DCIK细胞在无菌条件下静脉输注亚健康者本人。细胞注射后的安全性 观察：发热、失眠、厌食和发疹等。剩余细胞用自体血浆或血清（90% )加 DMS0(10% )液氮 冻存备用。
7. 根据权利要求1所述的一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术，其特征是：所述步 序（6)随访及康复方案调整。细胞移植后对亚健康者进行健康访问、复查，并根据康复结果 调整康复计划。
【专利摘要】一种亚健康康复用自体免疫细胞新技术属于第三类医疗技术，按照如下步序进行：(1)亚健康人群筛选，(2)自体免疫细胞的采集，(3)自体免疫细胞在GMP车间培养诱导，(4)免疫细胞制剂的质量控制，(5)细胞移植，(6)随访及康复方案调整。采用自体免疫细胞进行亚健康康复，一方面可以免去配型及一些传染病指标的检测，另一方面也快捷方便，更重要的是由于采用的是自体细胞，完全没有任何的排异反应，只要亚健康者没有特殊的身体疾病状况均可移植并产生良好康复效果。同时，不像其它亚健康康复法如中医疗法、自然疗法、运动、营养疗法，自体免疫细胞康复法可以从根本上改善亚健康人群身体状况，恢复原有的健康。
【IPC分类】A61K35-15, C12N5-0783, A61P37-04, C12N5-0784, A61K35-17
【公开号】CN104651307
【申请号】CN201310589031
【发明人】孙勇
【申请人】孙勇
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月21日