一种含真菌α-淀粉酶的啤酒复合酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶制剂制备技术领域，具体是一种含真菌a-淀粉酶的啤酒复合酶及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 啤酒营养丰富，酒精含量低，以其特有的泡沫和特殊的香味，深受广大消费者喜 爱，啤酒中含有人体必需的维生素、氨基酸和碳水化合物等营养物质，适量的饮用啤酒有利 于人体健康，故啤酒享有"液体面包"的美名。
[0003] 我国啤酒业发展迅速，啤酒产量已连续几年位居世界首位，但遗憾的是，国产大麦 的发展却出现了徘徊不前的窘况。其根本原因是受土质、气候、品种、发芽方法、工艺条件等 的制约，国产麦芽的品质一直较低。大的啤酒集团不惜高价进口一类澳麦和法麦为啤酒生 产原料，国产大麦由于受诸多因素影响，本身的淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、磷酸酯酶、氧 化还原酶等在发芽过程中分泌不足，导致啤酒麦芽中葡聚糖、半纤维素、蛋白质等含量 过高，造成糖化后麦汁质量和产量双低，不能生产高端啤酒。
[0004] 随着各种啤酒原料价格的不断上涨，特别是进口麦芽、大米价格的直线上扬，直接 导致了啤酒生产成本的大幅上升。为维持企业的生存和发展，各个啤酒厂都在积极应对此 项问题，通过技术创新和提高辅料比例来消化成本上升的压力，在这种形势下，原料中添加 小麦芽及淀粉质辅料成为啤酒企业的主要选择。
[0005] 在大麦芽质量较差以及添加淀粉质辅料较多的情况时，酶制剂的添加成为一种必 要。目前，酶制剂市场啤酒复合酶种类较多，按照添加工序来划分，可以分为糖化工序、发酵 工序、过滤工序及灌装工序啤酒复合酶，以糖化工序添加的复合酶较多，其主要的复配原则 是以啤酒麦芽酶系为基础进行淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、磷酸酯酶、氧化还原酶等酶制 剂的优化组合，成功解决了因为麦芽质量差或辅料添加量高而引起的糖化不完全、浸出率 低，麦汁粘度大、过滤困难，蛋白质溶解不充分、a-氨基氮含量低等麦汁制造难题。
[0006] 但是，当啤酒酿造过程中为了降低生产成本，提高辅料使用比例时，虽然添加外加 酶制剂糖化可有效改善啤酒口味，降低色度、总酚，延长啤酒保质期，但同时也会产生许多 负面影响，如氮源不足、过滤困难、非生物稳定性降低等，造成酿制出的啤酒氨基酸水平低、 营养价值不高，啤酒的泡沫性能差、泡沫不丰富，麦芽香味不足等质量缺陷，失去了传统啤 酒的本质口感和风味，称不上真正意义的啤酒。为此大多数啤酒生产厂家通过添加不同的 食品添加剂试图解决上述质量问题但效果仍不理想。中国专利CN103242996 B公开了一 种啤酒复合酶及其制备方法，所述啤酒复合酶以天然浓缩麦芽酶为主要原料，科学复配混 合酶，不仅补充了充足的酶源，更重要的是在保护剂和激活剂协同作用下，其酶活力更足、 保存性能更优越、氮源更丰富、麦芽香味更足，常温保存2年酶活损失在3%以下；中国专利 CN103865701A公开了一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶及其制备方法，所述啤酒复合酶中的 中性蛋白酶是由产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2-12为出发菌株经特定 发酵条件下的液体深层发酵而制备的，发酵液中性蛋白酶酶活力为5500-7000U/mL;上述 已经公开的啤酒复合酶虽然在啤酒酿造中发挥了重要的作用，但啤酒复合酶中真菌a-淀 粉酶的酶活力、热稳定性有待继续提高、复合酶酶系不全、啤酒复合酶组分没有添加消除自 由基并提尚酶活力的抗氧化剂，存在一定的缺陷。
【发明内容】
[0007] 本发明所解决的技术问题是克服了现有啤酒复合酶中真菌a_淀粉酶热稳定性 差、酶活力低、酶系不全，复合酶抗氧化能力低、酶活力损失大等缺陷，以浓缩麦芽酶和浓 缩麦汁粉为主要原料，科学复配耐高温、高活力真菌a-淀粉酶等食品级酶制剂、植物提取 物、抗氧化剂、保护剂、激活剂等；制得一种酶活力高、不易失活、麦芽香味浓、可为麦汁提供 丰富氮源的啤酒复合酶。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0009] 一种含真菌a-淀粉酶的啤酒复合酶，由以下重量份数的原料组成：
[0010] 浓缩麦芽酶48-52份，淀粉酶32-38份，蛋白酶20-30份，半纤维素酶15-30份，植 物提取物16-18份，浓缩麦汁粉15-17份，酯酶5-10份，保护剂3-5份，激活剂3-5份，抗氧 化剂1. 5-2. 5份；
[0011] 所述植物提取物中含有淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、酯酶、氧化还原酶等多种植 物酶；
[0012] 所述植物提取物中还含有植物多糖和单糖、植物淀粉、植物蛋白等营养物质，不仅 可为啤酒复合酶提供全面、丰富的植物酶，还可作为制备真菌a-淀粉酶的发酵培养基成 分，提高淀粉酶活力和微生物产酶能力；
[0013] 所述植物提取物采用超声清洗、微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、超滤浓 缩等低温提取技术，有效提高了原料利用率、植物酶活性和产率；有效保证了植物提取物的 食品安全性；
[0014] 所述植物提取物的制备方法为：将大麦芽、小麦芽和焦香麦芽按质量比 3-5:2-3:1-2均匀混合，粉碎至粒度0. 5-1_，得粉碎麦芽；然后将木瓜、菠萝、无花果分别 于超声波清洗机中在功率200W、频率30KHz条件下超声清洗5-10min，沥干，室温下破碎至 粒度0. 5-lmm，并按质量比3-5:3-5:1-3均匀混合，加入混合物质量2. 0-2. 5倍的粉碎麦芽 得原料混合物，加入原料混合物1-3倍的水，用柠檬酸调节pH值为3-4,在功率150-300W、 频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间60-80S，进行间隔式辐照：辐 照l〇s，间隔10s，控制温度20-35°C，如此辐照10次，同时在功率200-300W，频率30-40KHZ 条件下进行超声波辅助提取；保温l_3h，然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行 微波提取，其中，每次微波辐照总时间90-105S，进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制 温度40-60°C，如此辐照10次，同时在功率300-500W，频率40-50KHZ条件下进行超声波辅 助提取，最后自然降温至室温，于电场强度25-35kV/cm，脉冲时间400-600ys，脉冲频率 200-300HZ条件下进行高压脉冲电场（PEF)提取15-20min;提取液过滤得第一滤液，加滤渣 2倍的水漂洗、过滤得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1:1-2均匀混合，混合液 超滤浓缩、冷冻干燥、低温粉碎即得植物提取物；
[0015] 优选地，所述超声波清洗机中清洗液为0.55-0. 65%的碳酸氢钠溶液。
[0016] 所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：40%糖化酶，30% 真菌a-淀粉酶，15 %普鲁兰酶，10 % 淀粉酶，5 %中温a-淀粉酶；
[0017] 所述真菌a -淀粉酶是由里氏木霉（Trichoderma reesei) 901-18经培养基和 发酵工艺优化液体深层发酵而制备，该菌株已于2013年11月24日保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:M 2013602,分类命名为：里氏木霉901-18 Trichoderma reesei 901-18；
[0018] 所述里氏木霉901-18是由一株分离自湖南省津市市河堤食用菌培植基地土壤样 本的里氏木霉菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，所述菌株特点如下： 该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状、淡绿色，菌落扁平，高 0. 2-0. 8mm，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48h菌落直径达1. 5-8. 5mm, 72h达30_55mm; 菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2-5ym。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对 生。该菌株产a-淀粉酶的最适PH3. 0-6. 5 ;最适温度为27-30°C;
[0019] 优选地，所述真菌a-淀粉酶的制备方法包括以下步骤：保存完好的里氏木 霉CCTCC N0:M 2013602的菌种经斜面菌种活化、一级、二级、三级液体种子扩大培养至 种子罐，将种子罐液体种子以6 %接种量接入发酵罐培养基，培养温度27-30°C，搅拌速 度120-180r/m，通风量l-3vvm，培养时间10-15h ;然后以1-2°C /h降温速率缓慢降温 至10-15°C，搅拌速度250-300r/m，通风量l-2vvm，恒温培养15-20h ;继续以1-2°C /h降 温速率缓慢降温至2-5°C，此时，将种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培 养20-30h ;最后以1-2°C /h升温速率缓慢升温至10-15°C，搅拌速度200-400r/m，通风 量l-2vvm，恒温培养15-20h ;继续以1-2°C /h升温速率缓慢升温至27-30°C，恒温培养 15-20h ;发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体真菌a -淀粉酶；
[0020] 所述真菌a-淀粉酶制备过程中发酵结束，发酵液a-淀粉酶酶活力高达 17000-21000u/ml;酶温度适应范围较宽，为50-75°C之间，最适作用温度在65°C，70°C下保 存3h仍具有80%以上酶活，具有较好的热稳定性和保存活性；该酶最适反应pH值为5. 5， 在pH值4. 5-7. 0之间酶活保持在70%以上，比现有的真菌a-淀粉酶酶活力高，酶作用最 适pH值范围宽泛，耐温度高；
[0021] 所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物5-10g，酵母膏4g， 磷酸氢二钾2g，氯化镁0? 6g，氯化钾0? 8g，蒸馏水1000mL，pH值5. 8,121°C灭菌20min。
[0022] 所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮60_80g，玉米粉50_60g，豆饼粉 35-40g，海藻糖10-15g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，中草药提取物5-10g，硫 酸镁2-4g，磷酸氢二钾l-3g，纯净水1000mL，pH值5-7,121°C灭菌20min;
[0023] 所述种子罐培养基组成为：麸皮60-80g，玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g，海藻糖 l〇-15g，中草药提取物10-15g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，硫酸镁2-4g，磷酸 氢二钾l-3g，纯净水1000mL，pH值5-7,121°C灭菌20min;
[0024] 所述种子罐发酵液菌体浓度为7. Ox 108-8. Ox 108个/ml;
[0025] 所述发酵罐培养基组成为：麸皮60-80g，玉米粉50-60g，植物提取物40-60g，豆 饼粉35-40g，中草药提取物20-30g，