包含两种工程化改造成具有降低的和升高的效应器功能的抗体的组合物改进的免疫疗法
【专利说明】包含两种工程化改造成具有降低的和升高的效应器功能的 抗体的组合物改进的免疫疗法 发明领域
[0001] 一般而言，本发明涉及免疫疗法。更特别地，本发明关注靶向抗原的免疫缀合物和 Fc工程化抗体，其作为免疫治疗剂组合使用。另外，本发明涉及包含所述免疫缀合物和抗体 组合的药物组合物及在疾病的治疗中使用该组合的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 在多种临床背景中，经常期望选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，癌症治 疗的一个主要目的是特异性破坏肿瘤细胞，而使健康细胞和组织保持完整且未受损。
[0004] 实现这一点的一种诱人方式诱导针对肿瘤的免疫应答使得免疫效应细胞诸如天 然杀伤（NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞（CTL)攻击和破坏肿瘤细胞。效应细胞可通过多 种刺激来激活，包括多种细胞因子，它们经由结合免疫细胞表面上它们的受体来诱导信号 传导事件。例如，刺激细胞毒性T细胞和NK细胞增殖和激活等等的白介素-2 (IL-2)已经批 准用于治疗转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤。然而，血液清除迅速和缺乏肿瘤特异性要求系 统性施用高剂量的细胞因子以在肿瘤部位实现足够高浓度的细胞因子以激活免疫应答或 具有抗肿瘤效果。这些高系统水平的细胞因子可导致严重的毒性和不良反应，正如IL-2的 情况。为了在癌症治疗中使用，因此想要将细胞因子特异性投递至肿瘤或肿瘤微环境。这可 以通过将细胞因子缀合至靶向模块，例如对肿瘤抗原特异性的抗体或抗体片段来实现。此 类免疫缀合物的另一个优点是它们与未缀合细胞因子相比延长的血清半衰期。它们在更低 的剂量将肿瘤部位的免疫刺激活性最大化同时保持系统副作用最小的能力使得细胞因子 免疫缀合物成为最佳的免疫治疗剂。
[0005] 激活效应细胞的另一种方式是经由通过免疫球蛋白的Fc部分或包含Fc区的重 组融合蛋白衔接它们表面上的活化性Fc受体。抗体由其Fc区介导的所谓效应器功能是 基于抗体的癌症免疫疗法中的一种重要作用机制。当结合至细胞表面的抗体与NK细胞上 的Fc受体相互作用时，触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，由NK细胞破坏抗体包被的 靶细胞（例如肿瘤细胞）。NK细胞表达FcyRllla(⑶16a)，其识别IgGl或IgG3亚类的免 疫球蛋白。别的效应器功能包括抗体依赖性细胞介导的吞噬（ADCP)和补体依赖性细胞毒 性（CDC)，而且随抗体的类和亚类而变化，因为不同类型的免疫细胞携带不同套的Fc受体， 它们识别不同型和亚型的免疫球蛋白重链恒定域（例如a、S、 Y、e、或y重链恒定域， 分别与IgA、IgD、IgE、IgG、或IgM类抗体对应）。已经采用多种策略来提高抗体的效应器 功能。例如，Shields et al.，J Biol Chem 9 (2) ,6591-6604 (2001)显示 Fc 区位置 298、 333、和/或334 (EU残基编号方式）处的氨基酸替代改进抗体对FcyIlia受体的结合和 ADCC。例如，美国专利 No. 6, 737, 056 ;W0 2004/063351;及 W0 2004/099249 中记载了别的 具有Fc区中的氨基酸修饰且展现改进的Fc受体结合和效应器功能的抗体变体。或者，可 通过改变抗体的糖基化来获得升高的Fc受体结合和效应器功能。癌症免疫疗法中最常用 的抗体，IgGl型抗体具有Fc区每个CH2域中Asn 297处保守的N-连接糖基化位点。两个 附着至Asn 297的复合双触角寡糖埋藏在CH2域之间，形成与多肽骨架的广泛接触，而且 它们的存在对于抗体介导效应器功能（包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC))是 必须的（Lifely et al.，Glycobiology 5,813-822(1995) ;JefTeris et al.，Immunol Rev 163,59-76(1998) ;Wright and Morrison, Trends Biotechnol 15,26-32(1997))。蛋白 质工程研究显示了 FcyR与IgG CH2域的更低铰链区相互作用（Lund et al.，J Immunol 157,4963-69(1996))。然而，FcyR结合也要求存在CH2区中的寡糖（Lund et al.，J Immunol 157,4963-69(1996) ；ffright and Morrison, Trends Biotech 15,26-31 (1997)), 提示寡糖和多肽二者任一直接促成相互作用位点，或者维持活性CH2多肽构象需要寡糖。 因此可以作为提高IgGl和FcyR之间相互作用的亲和力，和提高IgGl抗体的ADCC活性 的手段来探索对寡糖结构的修饰。Umafia et al.，Nat Biotechnol 17,176-180(1999) 及美国专利No. 6, 602, 684(WO 99/54342)(据此通过提述完整收录其内容）显示催化两分 型寡糖形成的糖基转移酶，0 (1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)在中国仓鼠卵 巢（CH0)细胞中的过表达显著提高那些细胞中生成的抗体的体外ADCC活性。生产细胞 系中GnTIII的过表达产生两分型寡糖（它们一般也是非岩藻糖基化且属于杂合型）富 集的抗体。如果在GnTIII以外，还在生产细胞系中过表达甘露糖苷酶II(Manll)，那么获 得复合型的两分型、非岩藻糖基化寡糖富集的抗体（Ferrara et al.，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006))。两种类型的抗体均显示与具有未修饰聚糖的抗体相比强烈升高 的ADCC，但是只有大多数N-聚糖为复合型的抗体能够诱导显著的补体依赖性细胞毒性 (Ferrara et al.，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006))。ADCC 活性升高的关键因素看 来是自寡糖核心最里面的N-乙酰葡糖胺残基消除岩藻糖，这改进IgG Fc域对FcyRIIIa 的结合（Shinkawa et al.，J Biol Chem 278,3466-3473(2003))。别的用于生成具有岩 藻糖基化降低的抗体的方法包括例如在a (1，6)_岩藻糖基转移酶缺陷宿主细胞中表达 (Yamane-Ohnuki et al. , Biotech Bioeng 87,614-622(2004) ；Niwa et al. , J Immunol Methods 306,151-160(2006))。
[0006] 尽管通过使用游离细胞因子、免疫缀合物或工程化抗体在抗癌免疫疗法中实现了 成功，然而癌症疗法持续需要新的有效且安全的治疗选项。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明人发现，这两种用于局部免疫细胞激活的策略的组合，即细胞因子免疫缀 合物和工程化改造成具有升高的效应器功能的抗体对效应细胞的同时刺激，大大提高抗癌 免疫疗法的功效。
[0009] 因而，本发明提供（a)包含工程化改造成具有降低的效应器功能的第一抗体和效 应器模块的免疫缀合物，和（b)工程化改造成具有升高的效应器功能的第二抗体的组合， 其用于在有所需要的个体中治疗疾病。在一个实施方案中，所述效应器模块为细胞因子。 在一个实施方案中，所述细胞因子选自下组：IL_2, GM-CSF，IFN-a，和IL-12。在一个特定 实施方案中，所述效应器模块为IL-2。在另一个实施方案中，所述效应器模块为IL-12。在 另一个特定实施方案中，所述IL-2效应器模块为突变型IL-2效应器模块，其包含至少一处 与非突变型IL-2效应器模块相比降低或消除突变型IL-2效应器模块对IL-2受体a亚 基的亲和力但保留突变型IL-2效应器模块对中间亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突 变，特别是氨基酸替代。在一个具体实施方案中，所述突变型IL-2效应器模块在选自与人 IL-2(SEQ ID N0:1)残基42、45、和72对应的位置的一个、两个或三个位置处包含一处、两 处或三处氨基酸替代。在一个更加具体实施方案中，所述突变型IL-2效应器模块在与人 IL-2残基42、45和72对应的位置处包含三处氨基酸替代。在一个甚至更加具体实施方案 中，所述突变型IL-2效应器模块为包含氨基酸替代F42A、Y45A和L72G的人IL-2。在某些 实施方案中，所述突变型IL-2效应器模块在与人IL-2位置3对应的位置处另外包含氨基 酸突变，其消除IL-2的0-糖基化位点。在一个具体实施方案中，所述突变型IL-2效应器 模块包含氨基酸序列SEQ ID N0 :2。在一个实施方案中，所述效应器模块为单链效应器模 块。
[0010] 在一个实施方案中，所述第一抗体是全长IgG类抗体，特别是全长IgGl亚类抗 体。在一个实施方案中，所述效应器模块与所述第一抗体共享氨基或羧基末端肽键。在一 个实施方案中，所述效应器模块与所述第一抗体分享氨基末端肽键。在一个实施方案中， 所述效应器模块在其N末端处融合至所述第一抗体的重链之一的C末端。在一个特定实 施方案中，所述免疫缀合物包含不多于一个效应器模块。在一个实施方案中，所述免疫缀 合物基本上由通过一个或多个肽接头连接的效应器模块和第一抗体组成。在一个具体实 施方案中，所述免疫缀合物包含效应器模块，特别是单