一种以冬凌草为原料制备高纯度冬凌草甲素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工领域，尤其涉及一种利用济源冬凌草为原料制备高纯度冬凌草甲素的方法。
【背景技术】
[0002]冬凌草是一种唇型科香茶菜属的草本植物，其茎和叶可以作为药用。该植物广泛分布在黄河流域以南省区，其中河南济源是该植物主要产地。冬凌草具有清热解毒、消炎止痛，健胃活血及其抗肿瘤的功效。并且在1977年所出版的药典中收录了该植物，民间的医疗史料也曾证明了该植物可以用于治疗食道癌等多种疾病并且药用价值显著。文献中曾经报道了，冬凌草的茎和叶中含有多种萜类物质，其中包括:二萜、单萜、倍半萜以及三萜等。除萜类占主要成分外，还有其他天然化合物存在冬凌草这种植物中，如挥发油、甙类、多糖、黄酮等等。根据当前的药理活性研宄结果表明，冬凌草中发挥临床治疗效果的主要化合物成分是冬凌草甲素。
[0003]冬凌草甲素，其分子式为C2tlH28O6，分子量不大，值为364.42。其化合物骨架如图1.前人文献报道该化合物易溶解于甲醇和丙酮，不溶于苯，醚和氯仿，以往的冬凌草生产工艺中集中于报道用有机溶剂萃取除杂的思路来提高目标产物的纯度，有机溶剂(石油醚及氯仿等)消耗量过大，不易于天然活性成分的大规模生产，并且相关的工艺生产粗糙，产品质量不高。
[0004]天然化合物分离提取工艺设计首先考虑目标化合物及杂质间的相似性，然后根据目标化合物的结构来选择提取的溶剂、柱层析分离过程中的洗脱溶剂、萃取的溶剂及结晶溶剂。工艺中各操作单元间的耦合设计取决于目标产物及杂质的相似性，而分离体系中所有化合物结构的相似性又是由最初的提取操作单元决定的。除此之外，乙酸乙酯-甲醇-水组成的三相萃取未见报道用于冬凌草甲素的提纯工艺中来提纯脱色，该步骤为超声辅助结晶的最后纯化的进行做了保证晶体色泽的准备。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种利用冬凌草制备冬凌草甲素的方法，以解决上述问题。本发明的实施例提供了一种利用济源冬凌草制备冬凌草甲素的方法，包括如下步骤:
[0006]一种利用冬凌草来制备高纯度冬凌草甲素的方法，其特征在于包括如下步骤:
[0007]I)冬凌草甲素的两次提取工艺
[0008]用于该工艺设计中的冬凌草茎和叶首先要经过粉碎，其粉碎物进行两种溶剂提取，首先，无水乙醇回流提取，提取时间为l_3h，提取原料质量与提取溶剂的体积比为1:10-13，该量度的单位为g/mL。提取温度为80°C，提取两次后合并提取液旋转蒸发至提取液体积是原提取液体积的1/100。向提取器中加水，其体积为乙醇所用量的一半，100°C下，回流提取l-3h。
[0009]2) HP-20大孔吸附树脂工业预纯化实验设计
[0010]该专利中准确提供了两种规模的大孔树脂柱层析实验，即冬凌草甲素的小试规模实验和中试规模实验。具体列举如下:
[0011]用于小试规模的玻璃填充柱的直径和高度分别为3cm和100cm，HP-20型号大孔树脂的填充体积为300mL，上样浓度为0.5-0.65mg/mL,流速2_3.5mL/min,上样体积为5-6L。洗脱流速为2-3.5mL/min，水洗1500_2000mL后，用体积含量为20%的乙醇洗脱，前1500-2000mL用于除杂，随后接7000_9000mL含有冬凌草甲素的洗脱液。
[0012]中试规模的层析柱的直径和高度分别为12cm和2m。将40L的HP-20大孔树脂填充入柱子中，控制上样液浓度范围为1-1.5mg/mL，上样的流速范围300_350mL/min，上样时间为ll-13h。洗脱步骤中流速为300-400mL/min，用200-280L的水洗脱后，在用200-280L的体积含量为20%乙醇水溶液除杂，最后，用900-1200L的体积含量为20%无水乙醇溶液用于洗脱冬凌草甲素。
[0013]3)三种溶剂(乙酸乙酯-甲醇-水溶液)萃取脱色并进一步除杂
[0014]首先，配置体积含量为29%的甲醇水溶液，然后将乙酸乙酯和该甲醇水溶液等体积混合后形成三种溶液两相体系。单相萃取液体体积与树脂预纯化得到浸膏中含有的纯的冬凌草甲素质量比为1:9-15，该量度的单位为17^。萃取后，收集乙酸乙酯相，旋转蒸干后得到冬凌草甲素浸膏。
[0015]4)超声波辅助冷却结晶得到冬凌草甲素的晶体
[0016]配置体积含量为33%的甲醇水溶液，将萃取后得到的浸膏溶解于该甲醇水溶液中，控制冬凌草甲素的浓度为45-53mg/mL，随后超声波清洗器中超声，超声温度为25°C，超声时间为15-20min，白色的大粒晶核析出，4_6°C冰箱保存2天，后_8°C结晶10-12小时。离心得到固体结晶产品，用2L的水洗涤产品两次，每次分别静置于_8°C的结晶器中2小时后离心得到白色粉末，烘干机烘干得到冬凌草甲素粉末。
[0017]进一步，步骤I)提取原料质量与提取溶剂的体积比为1:11，该量度的单位为g/mL,乙醇的提取时间为2h，水的提取时间也为2h。
[0018]进一步，步骤2)小试规模的工艺中，上样液浓度为0.55mg/mL,流速为2.5mL/min,上样体积为6L。洗脱流速为2mL/min，水洗液的体积为1800mL，用2000mL体积含量为20%乙醇水溶液体积为除杂，随后用9000mL的体积含量为20%乙醇水溶液收集预纯化得到的冬凌草甲素产品。步骤2)中试规模工艺中，上样液浓度为lmg/mL，上样流速为300mL/min，上样时间为12h，洗脱流速为300mL/min。水洗液的体积200L，用240L体积含量为20 %乙醇水溶液用于除杂，随后，用1200L的体积含量为20%乙醇水溶液收集预纯化得到的冬凌草甲素产品。
[0019]进一步，步骤3)单相萃取液体体积与树脂预纯化得到浸膏中含有的纯的冬凌草甲素质量比为1:10，该量度的单位为L/g。
[0020]进一步，步骤4)将萃取后得到的浸膏溶解于33%的甲醇48mg/mL的冬凌草甲素溶液，超声时间20min，可看到有白色的大粒晶核析出，4°C冰箱保存2天，后_8°C结晶12h。
[0021]与现有文献中的冬凌草甲素生产工艺相比，本发明有益的效果是:本工艺中所用的试剂主要是水，无水乙醇，虽然在关键萃取和结晶单元中也有用到乙酸乙酯和少量的甲醇，但是这两种试剂相对于水和乙醇用量微量。全套工艺回避了已有的冬凌草甲素纯化文献中所提到的石油醚、氯仿、丙酮及乙醚等多种毒性大的有机试剂。本工艺引入了大孔树脂柱层析分离操作单元，该单元工艺操作条件温和，不存在环境污染，萃取中引入三相萃取技术充分利用了溶剂极性表中三种高等极性的试剂调节配比实现了脱色提纯的效果，最后超声波辅助结晶技术得到了 98%的冬凌草甲素产品，并且该工艺成本低廉，工艺简单，产率高，适合大规模工业化生产。
【附图说明】
[0022]图1是冬凌草水粗提取液的色谱图以及该化合物化学结构图
[0023]图2是一种利用济源冬凌草制备高纯度冬凌草甲素的工艺流程图
[0024]图3是本发明实施例1利用分析型高效液相色谱测定冬凌草甲素的纯度的分析图
[0025]图4是本发明实施例1利用质谱对产品进行鉴定的鉴定图
【具体实施方式】
[0026]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
[0027]参图1至参图4所示，图1是冬凌草甲素的化合分子结构图；图2是本发明一种利用济源冬凌草制备冬凌草甲素的方法的流程图；图3是本发明实施例1利用分析型高效液相色谱测定冬凌草甲素纯度的分析图；图4是本发明实施例1利用质谱对产品进行鉴定的鉴定图。
[0028]本发明的实施方式提供了利用冬凌草制备冬凌草甲素的方法，包括以下步骤:
[0029]I)冬凌草甲素的两次提取工艺
[0030]用于该工艺设计中的冬凌草茎和叶首先要经过粉碎，其粉碎物进行两种溶剂提取，首先，无水乙醇回流提取，提取时间为l_3h(可以为lh、2h、3h)，提取原料质量与提取溶剂的体积比为1:10-13(可以为1:10、1:11、1:12、1:13)，该量度的单位为g/mL。提取温度为80°C，提取两次后合并提取液旋转蒸发至提取液体积是原提取液体积的1/20。向提取器中加水，其体积为乙醇所用量的一半，100°c下，回流提取l-3h(可以为lh、2h、3h)。
[0031]2) HP-20大孔吸附树脂工业预纯化实验设计
[0032]大孔树脂作为一种有机聚合物球状介质是一种很好工业柱层析填充介质。在天然化合物的预纯化工业生产中，这种大孔树脂填充柱能够很好地发挥其高效富集化合物的效果取决于树脂本身聚合物对天然化合物的吸附作用和柱层析这个操作单元能够实现动态生产。在该专利中，我们充分考虑了冬凌草甲素这一三萜类化合物的性质后选择了 HP-20大孔吸附树脂作为柱子的填充介质，进行了两种规模的大孔树脂柱层析实验:
[0033]用于小试规模的玻璃填充柱的直径和高度分别为3cm和100cm，HP-20型号大孔树脂的填充体积为300mL，上样浓度为0.5-0.65mg/mL(可以为0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL)，流速 2-3.5mL/min(可以为 2mL/min、2.5mL/min、3mL/min、3.5mL/min)，上样体积为 5-6L(可以为 5L、5.2L、5.4L、5.6L、5.8L、6L)。洗脱流速为 2-3.5mL/min(可以为 2mL/min、2.5mL/min、3mL