/min、3.5mL/min)，水洗 1500_2000mL(可以为 1500mL、1600mL、1700mL、1800mL、1900mL、2000mL)后，用体积含量为20%的乙醇洗脱，前1500_2000mL(可以为 1500mL、1600mL、1700mL、1800mL、1900mL、2000mL)用于除杂，随后接 7000_9000mL (可以为7000mL、7500mL、8000mL、8500mL、9000mL)含有冬凌草甲素的洗脱液。
[0034]中试规模的层析柱的直径和高度分别为12cm和2m。将40L的HP-20大孔树脂填充入柱子中，控制上样液浓度范围为1-1.5mg/mL(可以为lmg/mL、l.lmg/mL、l.2mg/mL、
1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL)，上样的流速范围 300-350mL/min (可以为 300mL、310mL、320mL、330mL、340mL、350mL)，上样时间为 ll_13h(可以为 llh、ll.5h、12h、12.5h、13h)。洗脱步骤中流速为 300-400mL/min(可以为 320mL/min、340mL/min、360mL/min、380mL/min、400mL/min)，用 200_280L(可以为 200L、220L、240L、260L、280L)的水洗脱后，在用200-2801^(可以为2001^、2201^、2401^、2601^、2801^)的体积含量为20%乙醇水溶液除杂，最后，用 900L-1200L(可以为 900L、950L、1000L、1050L、1100L、1150L、1200L)的体积含量为 20%无水乙醇溶液用于洗脱冬凌草甲素。
[0035]3)三种溶剂(乙酸乙酯-甲醇-水溶液)萃取脱色并进一步除杂
[0036]将大孔树脂预纯化得到的浸膏进行结晶前的处理即萃取。该步骤对于得到好的色泽高纯度的冬凌草甲素产品至关重要。该步骤中首先要配置体积含量为29%的甲醇水溶液，然后将乙酸乙酯和该甲醇水溶液等体积混合后形成三种溶液两相体系。单相萃取液体体积与树脂预纯化得到浸膏中含有的纯的冬凌草甲素质量比为1:9-15(可以为1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15)，该量度的单位为L/g。萃取后，收集乙酸乙酯相，旋转蒸干后得到冬凌草甲素浸膏。
[0037]4)超声波辅助冷却结晶得到冬凌草甲素的晶体
[0038]配置体积含量为33 %的甲醇水溶液，将萃取后得到的浸膏溶解于该甲醇水溶液中，控制冬凌草甲素的浓度为45_53mg/mL(可以是45mg/mL、46mg/mL、47mg/mL、48mg/mL、49mg/mL、50mg/mL、51mg/mL、52mg/mL、53mg/mL)，随后超声波清洗器中超声，超声温度为25°C，超声时间为 15_20min (可以为 15min、16min、17min、18min、19min、20min)，白色的大粒晶核析出，4-6°C (可以为4°C、5°C、6°C )冰箱保存2天，后_8°C结晶10_12h (可以为10h、llh、12h)。离心得到固体结晶产品，用2L的水洗涤产品两次，每次分别静置于_8°C的结晶器中2h后离心得到白色粉末，烘干机烘干得到冬凌草甲素粉末。
[0039]本专利中整个冬凌草甲素生产工艺包含四个关键的操作单元，四个单元间准确的耦合衔接的切入点就是根据色谱图选择溶剂的思路。根据溶剂极性表中，极性从大到小的顺序为水(极性指数为10.2)、甲醇(极性指数5.1)、乙酸乙酯(极性指数4.4)、乙醇(极性指数4.3)。我们的工艺正是选取了溶剂极性表中这四种极性最大的溶剂。在提取阶段，乙醇首先作为最初的提取溶剂对粉碎后的冬凌草茎和叶子粉末进行提取，根据冬凌草甲素的分子式结构及分子量大小，从理论上可以判定的是在合适的工业操作条件下，乙醇是可以接近完全提取出原料中所含有的所以的冬凌草甲素的。以乙醇做为极性尺度的最低点，水可以做为极性尺度的最高点，由此，对乙醇提取后得到的浸膏进行二次提取以获得含有冬凌草甲素的水提液为目的，同时为大孔树脂柱层析预纯化的进行做了准备工作。
[0040]分析型高效液相色谱检测条件的建立不仅仅对于化合物的准确定性和定量至关重要，更是各个分离操作单元中关键溶剂选择设计的可靠判据。该专利中所用到的冬凌草甲素的色谱检测条件如下:在紫外检测波长242nm下，C18迪马柱子为固定相，甲醇和水溶液作为流动相，流动相配比随时间变化如下:0-22min内，甲醇与水的比例为:53:47 ;22-30min内，水的比例从47%降低到O ;30_38min内，甲醇的比例上升为53% ;38_45min，甲醇和水比例保持在53:47，在该色谱检测条件下，检测含有冬凌草甲素的水溶液后得到图1.
[0041]色谱图中体现冬凌草甲素的保留时间为19.07min,对应的流动相中甲醇的比列为53%。大孔树脂柱层析中，纯化思路集中于选择水和乙醇分别作为极性最大和极性最小的溶剂通过调节二者配比后得到洗脱溶剂。这两种溶剂在我们所考虑的四种溶剂中不但在位置上处于两端，相对于中间的两种溶剂来说，水和乙醇环保无毒性，适合在预纯化阶段作为洗脱剂出现。色谱检测条件中，甲醇被选为洗脱剂，可是，若选择甲醇作为洗脱剂出现在大孔树脂柱子预纯化阶段的话，甲醇的沸点高也会给预纯化后的旋蒸带来困难，导致耗能量大。相比之下，乙醇更加合适。
[0042]当乙醇和水作为大孔树脂柱层析的洗脱剂时，一个由分析型色谱图原理出发的推算作为该专利核心出现来作为树脂层析分离中洗脱剂选择的依据。预纯化阶段，除杂是分离的主要目标，由色谱图可知，存在一个明显的杂质峰I在目标产物的出峰位置之前，该杂质的保留时间为9.408min。将极性参数和保留时间同时引入下面推算:树脂洗脱剂中乙醇的浓度=9.408/19.07X53% X4.3/5.1 = 22.05%^ 20% ,选择20%乙醇水溶液作为洗脱剂是有意放缓了洗脱速度保证中式柱层析得到产品的纯度和动态洗脱的稳定性。
[0043]三种溶剂萃取中选择水，甲醇，乙酸乙酯这种三种溶剂，主要因为甲醇的极性仅仅低于水，二者形成水溶液。常见的工艺中常常引入的是乙酸乙酯与水的两相萃取工艺，此种选择基于乙酸乙酯可以与水明显地分相。当甲醇同时作为第三种溶剂引入萃取中的时候，甲醇依然是溶解于水溶液中，整个萃取体系分为两相。同样，根据色谱图提出了一个确定萃取中甲醇水溶液中甲醇的量即甲醇配比=9.408/19.07X53%= 26.14%，该数据作为基本参照，实际萃取工艺中，将甲醇的浓度扩大到了 29%是为了减少萃取次数节省成本的同时来加大除杂和脱色的力度。
[0044]超声辅助结晶部分中依然选择甲醇水溶液作为初始溶剂来溶解萃取得到冬凌草甲素浸膏，此操作中的甲醇比例依然由色谱图的出峰时间进行一个基本判定。鉴于该步骤已经是纯化中最后一步目的获得高纯化水冬凌草甲素即标准品纯度(98%)的冬凌草甲素。所以甲醇水溶液浓度计算中也重点考虑了杂质峰2的保留时间(13.94min)，其计算结果为(13.94+9.408)/2/19.07X53%= 32.44%，根据其计算结果，本专利中最后将结晶溶解溶剂定为33 %的甲醇水溶液。
[0045]该实施方案中，充分利用了济源冬凌草植物资源，开发了以条新型的、环保的、并适合工业大规模生产的分离纯化出高纯度(98%)的冬凌草甲素，并且操作单元中均能保证冬凌草甲素的回收率为大于等于90 %。
[0046]下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述，但是这些实施例并不在于限制本发明的保护范围。
[0047]实施例1:将5kg的冬凌草茎和叶粉碎过20目筛子，将粉末浸入到50L的无水乙醇中，在80°C下回流提取2h后，过滤，滤渣再用50L的无水乙醇在相同条件下重复以上的操作。两次提取液合并后旋蒸至1L，将IL旋蒸剩下的乙醇提取液加入25L水，在100°C回流2h，最后，得到的冬凌草甲素的质量是原料重量的0.4%。
[0048]将300mL HP-20型号大孔树脂填充入直径为3cm高度为10cm的玻璃层析柱，上样浓度为0.5mg/mL,流速2.5mL/min,上样体积为5.2L，洗脱流速为2mL/min水洗2000mL后，用2000mL体积含量为20%乙醇水溶液洗脱杂质，后用7000mL体积含量为20%乙醇水溶液洗脱冬凌草甲素产品。回收率为90 %，产品纯度为63.74 %。
[0049]首先，配置234mL体积含量为29 %的甲醇水溶液，然后将乙酸乙酯和该甲醇水溶液等体积混合后形成三种溶液两相体系，即单相萃取液体体积与树脂预纯化得到浸膏中含有的纯的冬凌草甲素质量比为1:10，并且该量度的单位为L/g。萃取后，收集乙酸乙酯相，旋转蒸干后得到冬凌草甲素浸膏。该单元回收率为93%，产品纯度提高到78%。
[0050]配置体积含量为33 %的甲醇水溶液，将萃取后得到的浸膏溶解于该甲醇水溶液中，控制冬凌草甲素的浓度为50mg/mL，随后超声波清洗器中超声，超声温度为25°C，超声时间为20min，白色的大粒晶核析出，6°C冰箱保存2天，后_8°C结晶12h。该单元的回收率为91 %，最后得到的冬凌草甲素的纯度为97.1 %。
[0051]实施例2:将5kg的冬凌草粉碎过20目筛子，将粉末浸入到55L的无水乙醇中，在80°C下回流提取3h后，过滤，滤渣再用55L的无水乙醇在相同条件下重复以上的操作。两次提取液合并后旋蒸至1.1L，将1.1L旋蒸剩下的乙醇提取液加入27.5L水，在100°C回流2h，最后，得到的冬凌草甲素的质量是原料重量的0.42%。
[0052]将300mL HP-20型号大孔树脂填充入直径为3cm高度为10cm