一种梅花鹿鹿茸Tβ10重组蛋白及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种梅花鹿鹿茸Τβ 10重组蛋白及制备方法和应用，属于基因工程技 术领域。
【背景技术】
[0002] 鹿茸是一种传统中药材，在中国及周边国家拥有广泛的沿用历史和经验。中医理 论认为鹿茸具有生津补髓、强筋健骨的功效，是难得的药食同补佳品。现代生物学研宄发 现，鹿茸这些神奇的功效可能和鹿茸自身的一系列奇特的生物学现象间存在某种联系。鹿 茸首先是一种可以周期性完全再生的器官，这是其他哺乳动物器官所不具备的能力。其他 哺乳动物包括人类的某些器官在进化过程中丧失了再生的能力，仅有部分组织保留了有限 的再生能力，如人的指甲、肝脏等。而鹿茸可以完全再生，并且是在器官水平上的完全再生， 这一过程包括鹿茸内部的骨组织、血管、神经组织以及外层包裹的皮肤。再者鹿茸的再生/ 生长速度极快，在某些鹿种中可以达到2cm/天。如此迅速的生长速度需要一个完美的代谢 系统来供给充足的氧气、养分及代谢物的运输。而鹿茸的另一个特性就是，鹿茸的软骨组织 中富含血管，这一现象也是鹿茸独有的。正是鹿茸软骨组织中丰富的血管网络保证了鹿茸 快速生长的代谢需求。由于鹿茸具有独特的生长过程，对其生长机制的研宄一直是生物学 研宄的热点。
【发明内容】
[0003] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种梅花鹿鹿茸Τβ 10重组蛋白及制备方 法和应用，采用的技术方案如下：
[0004] 本发明的目的在于提供一种梅花鹿鹿茸T β 10重组蛋白，其特征在于，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 1所示。
[0005] -种编码如权利要求1所述的梅花鹿鹿茸T β 10重组蛋白的基因，其特征在于，其 核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0006] 所述梅花鹿鹿茸T β 10重组蛋白，其特征在于，在制备具有刺激血管生成作用的 药物中的应用。
[0007] -种如权利要求1所述的梅花鹿鹿茸T β 10重组蛋白的制备方法，该方法是构建 鹿茸cDNA文库，设计含有attB重组位点序列的引物，PCR扩增后回收PCR产物，利用获得 的PCR产物进行BP重组反应，获得初级载体，然后进行LR克隆反应，获得目标载体，在宿主 细胞中诱导表达目的蛋白，分离纯化、透析浓缩后获得T β 10重组蛋白。
[0008] 所述方法，步骤如下：
[0009] 1)构建鹿茸CDNA文库，设计含有attB重组位点序列的引物，利用该引物和CDNA 文库模板进行PCR扩增，回收PCR产物；
[0010] 2)将步骤1)获得的PCR产物，PD0NR201质粒和BP混合克隆酶进行BP重组反应， 获得初级载体PT β 10_GWEC. 4 ;
[0011] 3)将步骤2)获得的初级载体ρΤβ 10_GWEC. 4与PDEST17质粒和LR克隆混合酶进 行LR克隆反应，获得目标载体ρΤβ 10-GWD17. 7,双向DNA测序进行鉴定；
[0012] 4)将步骤3)得到的目标载体ρΤβ 10-GWD17. 7导入宿主细胞BL21-ST后，诱导表 达目的蛋白，分离纯化、透析浓缩，获得T β 10重组蛋白。
[0013] 优选地，步骤1)所述引物如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
[0014] 步骤1)所述PCR产物，是回收190bp的胶块得到的。
[0015] 步骤4)所述诱导，诱导剂为NaCl，诱导浓度为0. 3M，诱导时间0-2h。
[0016] 所述方法具体步骤如下：
[0017] 1)利用RACE cDNA扩增试剂盒构建鹿茸cDNA文库，设计含有attB重组位点序列 的引物，利用该引物和cDNA文库模板进行PCR反应，回收190bpPCR产物；所述引物如SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示；
[0018] 2)将步骤1)获得的PCR产物、pD0NR201质粒、TE、BP反应buffer和BP混合克隆 酶混合均匀后进行BP重组反应，将BP反应产物转移到DH5 α感受态细胞中，培养后将转化 产物经含卡那霉素的LB固体培养基筛选，用含卡那霉素的LB培养基培养后提取质粒，获得 初级载体 PT β 10_GWEC. 4 ;
[0019] 3)将步骤2)获得的初级载体ρΤβ 10_GWEC.4、pDEST17质粒、LR反应buffer、 TE和LR克隆酶混合均匀后进行LR克隆反应，将LR转化产物转移至BL21-ST感受态细胞 中，培养后将转化产物经含氨苄青霉素且无 NaCL的LB固体培养基筛选，挑取阳性克隆，用 含氨苄青霉素的LB液体培养基扩增培养，提取质粒并双向DNA测序鉴定，获得目标载体 ρΤβ 10-GWD17. 7 ；
[0020] 4)将步骤3)得到的ρΤ β 10-GWD17. 7导入宿主细胞BL21-ST细胞中，用含氨苄的 LB培养基37°C培养18h进行预扩增，预扩增产物于含氨苄的LB培养基中，在30°C培养条件 下培养至〇D_为0. 7,加入NaCl使浓度为0. 3M诱导0-2h，收集细胞，离心弃上清后将细胞 置于-80°C保存；
[0021] 5)将步骤4)得到的细胞解冻后用裂解液重悬，加入溶解酵素至终浓度为lmg/mL， 冰上孵育30min，超声处理后抽提溶解产物，离心移入含Ni-NTA树脂悬液的锥形瓶中，混 匀后浇灌到聚乙烯层析柱上，收集流出液，经冲洗液冲洗，洗脱液洗脱后获得纯化的目的蛋 白，
[0022] 利用聚丙酰胺凝胶电泳检测蛋白；
[0023] 6)将步骤5)获得的洗脱液转载进透析盒中，然后转入IL的PBS缓冲液，4°C透析 18h，
[0024] 直至样品透析完全，置于_20°C保存，获得目的蛋白浓缩液。
[0025] 所述方法用于制备梅花鹿鹿茸T β 10重组蛋白。
[0026] 前期通过消减抑制杂交文库技术，发现了在鹿茸软骨血管壁高度表达的小分子蛋 白THYMOSIN BETA IO(TMO)，这个分子很可是刺激鹿茸软骨血管化的关键因子。
[0027] 本发明有益效果：
[0028] 本发明通过原核表达技术成功获得了 Τβ 10的重组蛋白，经过Huvec细胞成管实 验证实该蛋白具有刺激血管生成的作用。从梅花鹿鹿茸中获取T β 10对鹿茸快速生长机制 的研宄、鹿茸药效成分的研宄以及鹿茸高科技含量产品的开发都具有重大意义，具有广阔 的应用前景。
【附图说明】
[0029] 图1为pDEST 17多克隆位点。
[0030] 图2为T β重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图；
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