1] (ML，蛋白分子量标准；Ohr，诱导0小时细胞裂解液；lhr，诱导Ih细胞裂解液； 2hr，诱导2h细胞裂解液；ST，细胞培养液；CP，细胞沉淀；FT，洗脱液；El，诱导Oh细胞裂解 液纯化蛋白；E2,诱导Ih细胞裂解液纯化蛋白；E3,诱导2h细胞裂解液纯化蛋白）。
[0032] 图3为T β 10重组蛋白诱导HUVEC细胞血管成型；
[0033] (Α，阴性对照；Β，阳性对照（VEGF 40ng/ml) ;C，实验组（10ng/mL Τβ 10) ;D，实验 组（20ng/mL Τβ 10) ;E，实验组（40ng/mL Τβ 10) ;F，实验组（60ng/mL Τβ 10))。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0035] 实施例1 :Τ β 10表达序列的获得
[0036] 利用Clontech的SMARTtm-RACE cDNA扩增试剂盒构建的鹿茸cDNA文库，并结合 Gateway表达系统合成重组蛋白。在Gateway克隆技术（Life technoLogies)的使用范围 内，为了构建了细菌表达载体，设计了如下引物（SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4)，该引物在基 因特异序列5 '端前含有attB重组位点序列，
[0037]
【主权项】
1. 一种梅花鹿鹿茸TMO重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. -种编码如权利要求1所述的梅花鹿鹿茸T MO重组蛋白的基因，其特征在于，其核 苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 根据权利要求1所述梅花鹿鹿茸T 0 10重组蛋白，其特征在于，在制备具有刺激血管 生成作用的药物中的应用。
4. 一种如权利要求1所述的梅花鹿鹿茸T0 10重组蛋白的制备方法，其特征在于，构建 鹿茸cDNA文库，设计含有attB重组位点序列的引物，PCR扩增后回收PCR产物，利用获得 的PCR产物进行BP重组反应，获得初级载体，然后进行LR克隆反应，获得目标载体，在宿主 细胞中诱导表达目的蛋白，分离纯化、透析浓缩后获得T MO重组蛋白。
5. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 构建鹿茸cDNA文库，设计含有attB重组位点序列的引物，利用该引物和cDNA文库 模板进行PCR扩增，回收PCR产物； 2) 将步骤1)获得的PCR产物，pD0NR201质粒和BP混合克隆酶进行BP重组反应，获得 初级载体 PT 0 10_GWEC. 4 ; 3) 将步骤2)获得的初级载体pT M0_GWEC. 4与pDEST17质粒和LR克隆混合酶进行 LR克隆反应，获得目标载体pT 0 10-GWD17. 7,双向DNA测序进行鉴定； 4) 将步骤3)得到的目标载体pTM0-GWD17. 7导入宿主细胞BL21-ST后，诱导表达目 的蛋白，分离纯化、透析浓缩，获得T MO重组蛋白。
6. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤1)所述引物如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
7. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤1)所述PCR产物，是回收190bp的胶块 得到的。
8. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤4)所述诱导，诱导剂为NaCl，诱导浓度 为0. 3M，诱导时间0-2h。
9. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 利用RACE cDNA扩增试剂盒构建鹿茸cDNA文库，设计含有attB重组位点序列的引 物，利用该引物和cDNA文库模板进行PCR反应，回收190bpPCR产物；所述引物如SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示； 2) 将步骤1)获得的PCR产物、pD0NR201质粒、TE、BP反应buffer和BP混合克隆酶混 合均匀后进行BP重组反应，将BP反应产物转移到DH5 a感受态细胞中，培养后将转化产物 经含卡那霉素的LB固体培养基筛选，用含卡那霉素的LB培养基培养后提取质粒，获得初级 载体 pT 0 10_GWEC. 4 ; 3) 将步骤2)获得的初级载体pT 0 10_GWEC. 4、pDEST17质粒、LR反应buffer、TE和 LR克隆酶混合均匀后进行LR克隆反应，将LR转化产物转移至BL21-ST感受态细胞中， 培养后将转化产物经含氨苄青霉素且无NaCL的LB固体培养基筛选，挑取阳性克隆，用 含氨苄青霉素的LB液体培养基扩增培养，提取质粒并双向DNA测序鉴定，获得目标载体 pT0 10-GWD17. 7 ； 4) 将步骤3)得到的pTM0-GWD17. 7导入宿主细胞BL21-ST细胞中，用含氨苄的LB 培养基37°C培养18h进行预扩增，预扩增产物于含氨苄的LB培养基中，在30°C培养条件下 培养至〇D_为0. 7,加入NaCl使浓度为0. 3M诱导0-2h，收集细胞，离心弃上清后将细胞置 于-80°C保存； 5) 将步骤4)得到的细胞解冻后用裂解液重悬，加入溶解酵素至终浓度为lmg/mL，冰上 孵育30min，超声处理后抽提溶解产物，离心移入含Ni-NTA树脂悬液的锥形瓶中，混匀后浇 灌到聚乙烯层析柱上，收集流出液，经冲洗液冲洗，洗脱液洗脱后获得纯化的目的蛋白，利 用聚丙酰胺凝胶电泳检测蛋白； 6) 将步骤5)获得的洗脱液转载进透析盒中，然后转入IL的PBS缓冲液，4°C透析18h， 直至样品透析完全，置于_20°C保存，获得目的蛋白浓缩液。
10.根据权利要求4-9所述方法，其特征在于，用于制备梅花鹿鹿茸T MO重组蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一种梅花鹿鹿茸Tβ10重组蛋白及制备方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法为构建鹿茸cDNA文库，设计含有attB重组位点序列的引物，PCR扩增后回收PCR产物，利用获得的PCR产物进行BP重组反应，获得初级载体，然后进行LR克隆反应，获得目标载体，在宿主细胞中诱导表达目的蛋白，分离纯化、透析浓缩后获得Tβ10重组蛋白。本发明通过原核表达技术成功获得了Tβ10的重组蛋白，经过Huvec细胞成管实验证实该蛋白具有明显的刺激血管生成的作用。
【IPC分类】A61K38-17, A61P9-10, C12N15-12, C07K14-47
【公开号】CN104744583
【申请号】CN201510180774
【发明人】褚文辉, 李春义, 王大涛, 刘喜乐, 金美伶, 孙红梅
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月16日