用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属检验检疫领域，具体涉及用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的高度传染性疾病，是目前种猪繁殖障碍的主 要疫病之一。主要表现为感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃 伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪）呼吸障碍，还会导致免疫抑制而引起多种其他疾病，同时也 是引起猪呼吸系统疾病复合体（porcine respiratory disease complex，PRDC)的重要病 原体之一，给我国乃至世界范围内规模化的猪生产带来巨大的威胁。
[0003] 由于本病的临床症状与解剖病理变化差异较大，缺乏特征性的病理变化，因此在 临床诊断上相当困难，常常根据临床特征结合实验室诊断进行综合诊断，主要包括抗原检 测和血清学诊断。由于PRRSV的广泛传播给世界养猪业造成了巨大的经济损失，本病已经 引起各国的高度重视。因此，开发一种特异性强、灵敏度高、简单易行、适合批量操作的新型 检测方法将具有重要的现实意义。
[0004] 液相芯片，也称为微球体悬浮芯片（Suspension Array，liquid chip)，是基于 xMAP (flexible Multi-Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台。该技术是20 世纪90年代中期发展起来的，被喻为后基因组时代的芯片技术，是集流式技术、荧光微球、 激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的新型生物分子高通量检测技术，它是在不同 荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应，通过红、绿两束激光 分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的。该技术的优势在于检测通量大、 速度快、灵敏度高、操作灵活、样本用量少、检测范围广、特异性强、准确性高、重复性好、费 用低。
[0005] 鉴于猪蓝耳病病毒的危害和现存检测该病毒方法尚存的一些弊端，本发明利用免 疫学技术和液相芯片技术相结合研制用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂盒。简言 之，采用单抗制备技术制备了猪蓝耳病病毒单克隆抗体，并与羧基化21号微球偶联，获得 捕获单抗-微球；采用多抗制备技术制备了兔源猪蓝耳病病毒多克隆抗体，经生物素化获 得了检测多抗；采用重组DNA技术制备了猪蓝耳病病毒3个抗原蛋白偶联体MNM，作为检测 标准品。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂盒。
[0007] -种重组蛋白基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。
[0008] 一种重组蛋白，它是序列表SEQ ID NO. 5所不的基因表达的蛋白。
[0009] 一种表达重组蛋白质粒，它是以PRRSV的总RNA，反转录成的CDNA为模板； 1) 用引物： PMl :5' AAGCTTATGGGGTCGTCTCTAGA 3' PM2 :5' CTCGAGTTTGGCATATTTGACA 3' 扩增，插入PMD18T中； 2) 用引物： PMN2-1 :5' GGATCCATGGGGTCGTCTCTAGA 3' PMN2-2 :5' GAATTCTGCTGAGGGTGATGCT 3' 扩增，插入pET28a中； 3) 将1)、2)获得的质粒，分别用Hind III和Xho I酶切采用T4DNA连接酶进行连接。
[0010] 一种重组蛋白在制备检测猪蓝耳病病毒检测试剂盒中的应用。
[0011] 用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂盒，它的抗原标准品为序列表SEQ ID NO. 5所不的基因表达的蛋白； 所述的抗原标准品的工作浓度为2 μ g/mL。
[0012] 本发明提供了用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂盒，病毒的浓度达到 IO1TCID5ci时仍可被检出，猪蓝耳病病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪 圆环病毒2型、猪脑心肌炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪脊髓灰质炎病毒无交叉反应，特异性强， 本发明还提供了抗原标准品，它的工作浓度为2 μ g/mL。
【附图说明】
[0013] 图1细胞融合； 图2纯化多克隆抗体的检测结果； 图3单抗偶联微球的最佳工作浓度； 图4试剂盒灵敏度检测结果； 图5试剂盒特异性检测结果；其中：1-3猪蓝耳病病毒病毒；5-6猪流行性乙型脑炎病 毒；7-9猪细小病毒（PPV) ; 10-12猪瘟病毒（CSFV) ; 13-15猪圆环病毒2型（PCV2) ; 16-18 猪脑心肌炎病毒（EMCV) ; 19-21猪伪狂犬病毒；22-24猪脊髓灰质炎病毒。
[0014] 附图6试剂盒重复性检测结果。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1猪蓝耳病病毒单克隆抗体的制备 (I) PRRSV的培养与免疫原的制备 Marc-145细胞常规复苏培养，待Marc-145细胞长成单层后，将纯化后的PRRSV病毒(本 实验室保存)，稀释至100 TCID5tl后，取ImL接种于Marc-145细胞单层上，常规增殖病毒操 作，在倒置显微镜下逐日观察细胞病变（CPE)，出现约80%的拉网，空泡、聚缩等细胞病变后 收获病毒。收毒时将细胞培养瓶快速置_70°C和37°C反复冻融三次，于4°C 5000r/min离 心30min，收集上清液(含PRRSV)，用0. 1%的甲醛灭活病毒36h，采用差速离心法纯化病毒， 将灭活后的病毒液于15000r/min，4°C离心20min，弃去沉淀，取高速离心的上清液于4°C， 30000r/min超速离心lh，弃去上清，用适量PBS缓冲液悬浮沉淀，再进行2次差速离心，最 后用适量PBS将沉淀溶解。4°C，5000r/min离心20min，取上清即为纯化的病毒液。
[0016] 取纯化的病毒，超声波粉碎仪裂解，用U2010紫外分光光度计于260nm与280nm下 测定吸光度，计算其蛋白浓度，用PBS稀释至15(^g/ml与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完 全佐剂混合制成乳剂，置4°C放置3d，若呈乳白色不分层，即可作为免疫原。
[0017] (2)小鼠免疫及血清效价检测 选择4-6周龄雌性Balb/c小鼠5只，用上述制备的弗氏完全佐剂疫苗进行首免，二免、 三免使用弗氏不完全佐剂制备的疫苗进行免疫注射，最后一次免疫于融合前3天进行加 强，具体免疫程序见附表1。
[0018]
【主权项】
1. 一种重组蛋白基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。
2. -种重组蛋白，它是序列表SEQ ID NO. 5所示的基因表达的蛋白。
3. -种表达重组蛋白质粒，它是以PRRSV的总RNA，反转录成的cDNA为模板； 1) 用引物： PMl :5' AAGCTTATGGGGTCGTCTCTAGA 3'（含 Hind III 酶切位点） PM2 :5' CTCGAGTTTGGCATATTTGACA 3'（含 Xho I 酶切位点） 扩增，插入PMD18T中； 2) 用引物： PMN2-1 :5' GGATCCATGGGGTCGTCTCTAGA 3'（含 BamH I 酶切位点） PMN2-2 :5' GAATTCTGCTGAGGGTGATGCT 3'（含 EcoR I 酶切位点） 扩增，产物插入pET28a中； 3) 将1)、2)获得的质粒，分别用Hind III和Xho I酶切，采用T4DNA连接酶进行连接。
4. 一种重组蛋白在制备检测猪蓝耳病病毒检测试剂盒中的应用。
5. 用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂盒，它的抗原标准品为序列表SEQ ID NO. 5所不的基因表达的蛋白。
6. 根据权利要求5所述的用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂盒，其特征在 于：所述的抗原标准品的工作浓度为2 y g/mL。
【专利摘要】本发明公开了用于检测猪蓝耳病病毒的液相芯片检测试剂盒，病毒的浓度达到101TCID50时仍可被检出，猪蓝耳病病毒、对猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪脑心肌炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪脊髓灰质炎病毒无交叉反应，本发明还公开了抗原标准品，它的工作浓度为2μg/mL。
【IPC分类】G01N33-569, G01N33-68, C12N15-40, C12N15-70, C07K14-08
【公开号】CN104744573
【申请号】CN201510140002
【发明人】孟日增, 石建平, 刘阳, 宋翱, 马文晨, 王玮琳, 王宁, 聂丹丹
【申请人】中华人民共和国吉林出入境检验检疫局
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月27日