一种从林蛙皮肤分泌物中分离的抗菌肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学和生物技术领域。
【背景技术】
[0002]抗菌肽又称肽抗生素或抗微生物肽，广泛分布于病毒、细菌、昆虫和各种动植物的体内，是具有消除体内突变细胞、抵抗外界微生物侵害的一类小分子多肽。抗菌肽不但具有广谱的抗菌活性，而且具有很高的抗菌效率等优点，而其最大的优点是不易引起细菌耐药性，是目前抗病原微生物药物开发研宄中的热点。
[0003]基于抗菌肽的重要作用，许多学者开展新型抗菌肽的寻找及制备研宄。目前寻找和制备抗菌肽有三种方法:化学合成、基因工程以及从生物中筛选天然抗菌肽类。化学合成的抗菌肽往往容易改变空间构象，从而失去活性。基因工程获取的抗菌肽虽然产量高，但还存在表达产物稳定性较差，以及翻译后修饰可能改变活性等问题。从来源丰富、价格低廉的生物中筛选制备抗菌肽具有很高的应用前景，因此倍受研宄者的青睐。
[0004]两栖类动物体型多样、种类繁多、分布广泛，兼具科研价值和经济价值两大特点。由于有多种功能复杂、能够抵御外界有害因子侵袭的生物活性物质存在于两栖类动物的皮肤中，因此，两栖动物的皮肤是重要的资源宝库，在天然抗菌肽筛选方面具有很大的开发潜力。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:提供一种从林蛙皮肤分泌物中分离的抗菌肽及其制备方法，它可从林蛙皮肤分泌物中分离出抑菌活性强的抗菌肽。
[0006]本发明的抗菌肽及其制备方法是:
林虫圭皮肤抗菌肽，其氨基酸序列为SEQ ID N0.1:Phe-Leu-Pro-Phe-Phe-Ala-Ala-Cys-Ala-1le-Thr-Lys-Lys-Cys，分子量为 1556.8 道尔顿。
[0007]所述抗菌肽氨基酸序列第8和14位之间形成一个二硫键。
[0008]其制备方法是
O提取皮肤分泌物:采用8-10厘米长的活体林蛙，用超纯水清洗干净，酒精棉擦拭后放在洁净的玻璃平皿上。用10伏稳压间断性的多点刺激蛙的耳后腺及背部，待观察到皮肤出现大量分泌液，用超纯水将分泌液冲洗下来，将这些分泌液收集，放在_70°C备用，即为林蛙皮肤分泌物粗提物；
2)分离纯化:取皮肤分泌物粗提物超速离心过滤后收集滤液。滤液通过C18半制备柱进行液相色谱分离。检测波长217nm，溶液A为含0.025%三氟乙酸的水溶液，溶液B为含
0.025%三氟乙酸的乙腈溶液；色谱柱使用前用溶液A平衡，柱子平衡后将滤液加到柱子上，上样量2mL/次，流速2mL/min，然后以梯度10%_60%加入溶液B，持续56min，收集具有最佳抗菌活性的峰。利用反相高效液相色谱对其进一步分离。采用C18分析柱，溶液Al组分为含0.1%三氟乙酸的水溶液，溶液BI组分为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。用前，柱子用溶液Al平衡，然后以lmL/min的流速将样品加到柱子上，以梯度10%_40%加入溶液BI，持续时间25min，再以梯度40%_60%加入溶液BI，持续时间45min，收集第4个峰的洗脱液，冷冻干燥即为所述抗菌肽。
[0009]本发明的有益效果是:该林蛙抗菌肽不仅对条件性致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强抗性，而且对于临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)也具有抑制作用。金黄色葡萄球菌是临床最常见的致病菌之一，其中以MRSA尤为重要，近年来由MRSA引起人类感染和死亡的报道越来越频繁，致病力越来越强，MRSA多重耐药性问题也日趋严峻，阐明MRSA耐药机制以及开发新型抗生素一直是研宄热点。本发明的抗菌肽对MRSA具有抑制作用，由于其抗菌机制的特殊性，临床上不会产生耐药性，有望开发成为抗临床耐药菌株乃至“超级细菌”的新型抗菌药物。
[0010]另外，该林蛙抗菌肽对人乳腺癌细胞MCF-7生长具有抑制作用，本发明的多肽属于小分子蛋白，与常规抗肿瘤药物相比，其更易于机体吸收，且毒副作用小，可作为在制备抗肿瘤药物中的应用。
【附图说明】
[0011]图1:利用制备型液相色谱分离林蛙皮肤分泌物的示意图；
图2:利用分析型液相色谱分离活性峰的示意图；
图3:抗菌肽对大肠杆菌ATCC25922的作用；
图4:抗菌肽对金黄色葡萄球菌ATCC25923的作用；
图5:抗菌肽对耐药金黄色葡萄球菌MRSA的作用；
图6:抗菌肽对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用示意图，其中纵坐标为人乳腺癌细胞MCF-7抑制率，横坐标为抗菌肽浓度。
[0012]图7:林蛙抗菌肽最小抑菌浓度。
【具体实施方式】
[0013]实施实例1:
林蛙皮肤抗菌肽的制备
I提取中国林蛙皮肤分泌液:8-10公分林蛙10只用超纯水清洗干净，用10伏稳压间断性的多点刺激蛙的耳后腺及背部，待产生大量分泌液后用超纯水冲洗并收集分泌液，12000rpm离心15分钟，取上清低温浓缩后，用1KDa超滤管于4°C超速离心，收集滤液。
[0014]2制备型液相色谱:C18半制备柱使用前用含0.025%三氟乙酸的水溶液平衡，取上述滤液上柱，上样量2mL/次，流速2mL/min，洗脱梯度:0~25min，0-10% (v/v)含0.025%三氟乙酸的乙腈溶液；25~81min，10%~60% (v/v)含0.025%三氟乙酸的乙腈溶液。检测波长217nm，洗脱曲线如图1所示。共收集36个洗脱峰，将各洗脱峰的洗脱液浓缩后进行抗菌活性检测。
[0015]3高效液相色谱:C18分析柱使用前用含0.1%三氟乙酸的水溶液平衡，取上述具有抗菌活性的洗脱液上柱，上样量25 μ L/次，流速lmL/min，洗脱梯度:0~25min，0-10% (v/v)含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；25~50min，10%~40%含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；50~95min，40%~60%含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。检测波长217nm，洗脱曲线如图2所示。收集5个洗脱峰，只有峰4具有抗菌活性，冷冻干燥后即为本发明所述抗菌肽。
[0016]林蛙抗菌肽的测序
本发明所提供的林蛙皮肤抗菌肽用Edman降解法测定N-末端氨基酸顺序，使用ABI公司Procise 491型蛋白质序列分析仪，采用自动Edman降解法进行测序，氨基酸衍生物采用毛细管液相色谱进行检测，与标准品苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)的保留时间进行比对，得到多肽的一级结构。
[0017]同时采用MALD1-T0F质谱技术鉴定氨基酸序列。根据测定的抗菌肽分子量，确定二级质谱的母离子，利用二级质谱测定方法获得二级质谱图，同时在二级质谱图上利用Y离子和B离子分别拼接出序列相反的两条序列。
[0018]本发明所提供的多肽经上述两种方法测序，序列为Phe-Leu-Pro-Phe-Phe-Ala-Ala-Cys-Ala-1Ie-Thr-Lys-Lys-Cys,且第8位和14位之间形成二硫键。将该抗菌肽的氨基酸序列通过 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)和 Antimicrobial Peptide Database(http://aps.unmc.edu/AP/ main.htmL)两大数据库进行搜索比对，未发现相同序列。
[0019]琼脂涂布法检测本发明所述抗菌肽抑菌活性
本实例所用抗菌肽由上海吉尔生化有限公司根据序列SEQ ID N0.1合成，纯度为95%。所用菌种为标准菌株大肠杆菌(Escherichia c