使用蛋白a亲和色谱法分离和纯化抗-il-13抗体的制作方法
【专利说明】使用蛋白A亲和色谱法分离和纯化抗-IL-13抗体
[0001] 本申请是国际申请日为2010年10月20日、国际申请号为PCT/US2010/053388、进 入国家阶段的申请号为201080057917. 5、发明名称为"使用蛋白A亲和色谱法分离和纯化 抗-IL-13抗体"的PCT申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用 本申请要求2009年10月20日提交的美国临时申请系列号61/253, 411的权益，该申 请通过引用整体并入本文。
【背景技术】
[0003] 人IL-13是从活化的T细胞克隆出的一种17-kDa糖蛋白，并由Th2谱系的活化 T细胞、ThO和ThI⑶4+ T细胞、⑶8+ T细胞和几种非-T细胞群体(诸如肥大细胞）生成 (Zurawski 和 de Vries, 1994 Tmmunol Today, 15，19-26)。IL-13 会促进人 B 细胞中的 免疫球蛋白同种型转换成 IgE (Punnonen, Aversa 等人 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3730-4)，并抑制人和小鼠中的炎症性细胞因子生产（de Waal Malefyt等人，1993，J Immunol, 151，6370- 81; Doherty 等人，1993，JImmunol, 151，7151-60)。IL-13 会 结合它的细胞表面受体IL_13Ral和IL-13Ra2。IL_13Ral以低亲和力（KD ~ IOnM)与 IL-13相互作用，随后被IL-4R募集，以形成高亲和力（KD ~ 0.4 nM)信号传递异源二聚受 体复合物（Aman 等人，1996，JBiol Chem, 271，29265-70; Hilton 等人，1996，Proc Natl Acad Sci USA, 93，497-501)。所述 IL-4R/IL-13Ral 复合物在诸如 B 细胞、单核 细胞/巨细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、气道上 皮细胞和气道平滑肌细胞等许多细胞类型上表达（Graber等人，1998，Eur J Immunol, 28，4286-98; Murata 等人，1998，Int Immunol, 10，1103-10; Akaiwa 等人，2001， Cytokine, 13，75-84)。IL-13Ral/IL-4R受体复合物的连接会导致多种信号转导途径的 活化，包括信号传导子及转录激活子（ST AT6)和胰岛素受体底物-2 (IRS-2)途径（Wang 等人，1995，Blood, 864218-27; Takeda 等人，1996，J Immunol, 157，3220-2)。单 独的IL-13Ra2链对IL-13具有高亲和力（KD ~ 0. 25-0. 4 nM)，并起下述两种作用：负调 节 IL-13 结合的诱傅受体（Donaldson 等人，1998，J Immunol, 161，2317-24)，和在巨 噬细胞和可能的其它细胞类型中通过AP-I途径诱导TGF-β合成和纤维化的信号传递受体 (Fichtner-Feigl, Strober 等人 2〇〇6 Nat Med I2 99_1〇6)〇
[0004] 在哮喘的临床前动物模型中进行的几项研宄指示，IL-13在哮喘中起重要作用。 这些数据包括：IL-13敲除的小鼠对哮喘的抗性，以及IL-13拮抗剂(可溶性的IL-13受体、 抗-IL-13 mAb等）在不同的小鼠模型中对哮喘表型的抑制（Wills- Karp和Chiaramonte, 2003, Curr Opin Pulm Med, 9 21-7; Wills-Karp, 2004, Tmmunol Rev, 202 175-90)。 多项研宄已经证实，重组IL-13向小鼠以及豚鼠的肺的药理学施用会诱导气道粘液分泌 过多、嗜酸粒细胞增多和气道高反应性("AHR"； Grunig等人，1998，Science, 282， 2261-3; Wills-Karp 等人，1998，Science, 282，2258-61; Kibe 等人，2003，AmJ Respir Crit Care Med, 167， 50-6; Vargaftig 和 Singer, 2003， Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284，L260-9; Vargaftig 和 Singer, 2003，Am J Respir Cell Mol Biol, 28，410-9)。在组成性地或诱导性地表达IL-13的转基因小鼠系统中，再现了 IL-13 的这些效应（Zhu 等人，1999，JClin Invest, 103，779-88; Zhu 等人，2001， Am J Respir Crit Care Med, 164，S67- 70; Lanone 等人，2002，J Clin Invest, 110463-74)。IL-13的慢性转基因过表达也会诱导上皮下纤维化和肺气肿。具有IL-13 (和IL-4)信号传递分子STAT6缺陷的小鼠不会形成变应原诱导的AHR和粘液过度生 成（Kuperman等人，2002，NatMed, 8，885-9)。使用可溶性的IL-13受体融合蛋白 (sIL_13Ra 2Fc)的研宄已经证实了该细胞因子在实验性变应原卵白蛋白（OVA)诱导的气 道疾病中的关键作用（Grunig 等人，1998，Science, 282，2261-3; Wills-Karp 等人， 1998，Science, 282，2258-61; Taube 等人，2002，J Immunol, 169，6482-9)。还在鼠 哮喘的慢性模型中，证实了抗-IL-13治疗的效力。除了表现出粘液分泌过多和AHR的特征 以外，该慢性哮喘模型表现出人疾病的几种标志，所述标志在更急性模型中不存在。这些标 志包括：位于上皮之间的间隙中的肺组织的嗜酸粒细胞增多以及通过胶原沉积的增加测得 的平滑肌纤维化。通过含有OVA的气雾剂的重复激发(每周1次，持续共4周），在OVA-敏 化的小鼠中诱导慢性哮喘模型。为最后2周的OVA激发(从第36天开始，在研宄的第53天 评估效力读出）施用的抗-IL-13抗体显著抑制了 AHR、肺炎、杯形细胞增生、粘液分泌过多 和气道纤维化（Yang 等人，2005，J Pharmacol Exp Ther, 313，8-15)。IL-13 涉入人哮 喘的发病机制中，因为在哮喘患者的肺中已经检测到高水平的IL-13 mRNA和蛋白，这与该 疾病的严重性相关联（Huang等人，1995，J Immunol, 155，2688-94)。另外，已经鉴别 了人IL-3遗传多态性(它们导致升高的IL-13水平)，并与哮喘和特应性相关联（Heinzmann 等人，2000，Hum Mol Genet, 9，549-59; Hoerauf 等人，2002，Microbes Infect, 4， 37-42; Vercelli, 2002, Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2, 389-93; Heinzmann 等 人，2003，J Allergy Clin Immunol, 112，735-9; Chen 等人，2004，J Allergy Clin Immunol, 114，553-60; Vladich 等人，2005，J Clin Invest, 115，747-54)，并且已 经在哮喘患者的肺中检测到升高的IL-13水平（Huang等人，1995，J Immunol，155， 2688-94; Arima 等人，2002，J Allergy Clin Immunol, 109，980-7; Berry 等人， 2004，J Allergy Clin Immunol, 114，1106-9)。还已经证实了 IL-13 和哮喘之间的遗传 联系，因为具有IL-13基因的多态性(这造成更高的血浆IL-13水平）的个体具有增加的特 应性和哮喘的风险（Wills-Karp, 2000，Respir Res, 1，19-23)。
[0005] 由于人IL-13在多种人病症中的作用，已设计治疗策略以抑制或抵消IL-13活性。 具体地，已寻求与IL-13结合且中和IL-13的抗体作为抑制IL-13活性的方法。但是，本领 域需要改良的用于生产和纯化这种用于药用的抗体的方法。本发明解决了这个需要。
【发明内容】
[0006] 在某些实施方案中，本发明涉及与IL-13结合的纯化、分离的抗体和抗体片段，以 及包括这样的抗体和片段的药物组合物。在某些实施方案中，本发明涉及与人IL-13结合 的分离的抗体或其抗原结合部分。本发明的分离的抗-IL-13抗体可以用于临床情况以及 研宄和开发中。在某些实施方案中，本发明涉及包括在图1中鉴定的重链和轻链序列的 抗-IL-13抗体。
[0007] 本发明的某些实施方案涉及从样品基质中纯化抗-IL-13抗体或其抗原结合部 分、以使所述抗体基本上不含有宿主细胞蛋白（"HCP"）和漏掉的蛋白A的方法。在某些方 面，样品基质（或简称"样品"）包括用于产生本发明的抗-IL-13抗体的细胞系。在具体方 面，样品包括用于生产人抗-IL-13抗体的细胞系。
[0008] 在某些实施方案中，本发明提供了纯化IL-13抗体的方法，其包括初步回收步骤， 以尤其去除细胞和细胞碎片。在上述方法的某些实施方案中，初步回收步骤包括一个或多 个离心或深度过滤（depth filtration)步骤。例如，并且非限制性地，这样的离心步骤可 以以约7000 X g至约11，000 X g执行。此外，上述方法的某些实施方案将包括深度过滤 步骤，例如去脂质（delipid)深度过滤步骤。
[0009] 在某些实施方案中，对初步回收的样品实施亲和色谱步骤。所述亲和色谱步 骤包括：将初步回收的样品上柱，所述柱包括合适的亲和色谱载体（chromatographic support)。这样的色谱载体的非限制性实例包括，但不限于：蛋白A树脂、蛋白G树脂、包括 产生的目标抗体所针对的抗原的亲和载体以及包括Fc结合蛋白的亲和载体。蛋白A树脂 可用于抗体（IgG)的亲和纯化和分离。在一个方面，在样品加载之前，用合适的缓冲液平衡 蛋白A柱。合适的缓冲液的一个实例是Tris/NaCl缓冲液（pH约7. 2)。在该平衡以后，可 以将样品加载到柱上。在加载柱以后，可以使用例如平衡缓冲液，洗涤柱一次或多次。在洗 脱柱之前，可以使用其它洗涤，包括采用不同缓冲液的洗涤。然后可以使用适当的洗脱缓冲 液，洗脱蛋白A柱。合适的洗脱缓冲液的一个实例是醋酸/NaCl缓冲液（pH约3. 5)。使用 本领域技术人员众所周知的技术，可以监测洗脱液。例如，可以跟踪在OD28tl的吸光度。然 后可以制备洗脱的目标级分，用于进一步处理。
[0010] 在本发明的某些实施方案中，在蛋白A亲和色谱法之后进行低pH调节步骤。在这 样的实施方案中，对包含假定的抗-IL-13抗体或其抗原结合部分的蛋白A洗脱液进行pH 调节，达到约3至约4的pH。在某些方面，将pH调节至约3.5。除了别的以外，所述低pH 会促进可能污染样品的pH-敏感的病毒的减少和/或灭活。在合适的时间段以后，将pH调 节至约4. 5至约6. 0之间，包括、但不限于约5. 0,并对样品进行其它纯化步骤。
[0011] 在某些实施方案中，在蛋白A亲和色谱法或低pH调节步骤以后，进行离子交换步 骤。该离子交换步骤可以是阳离子或阴离子交换或两者的序贯组合。该步骤可以是单个离 子交换操作，或可以包括多个离子交换步骤，例如阳离子交换步骤之后为阴离子交换步骤， 或反之亦然。在一个方面，离子交换步骤涉及单步操作。在另一个方面，离子交换步骤涉及 两步离子交换过程。合适的阳离子交换柱是其固定相包括阴离子基团的柱。这样的柱的一 个实例是Fractogel ? SO3'该离子交换捕获色谱步骤会促进从样品中分离抗体。合适的 阴离子交换柱是其固定相包括阳离子基团的柱。这样的柱的一个实例是Q Sepharose?柱。 一个替代方案是Pall Mustang Q膜筒。一个或多个离子交换步骤通过减少杂质进一步分 离抗体，所述杂质如宿主细胞蛋白和DNA以及在可适用时的亲和基质蛋白。该阴离子交换 操作是色谱的流通（flow through)模式，其中目标抗体不与阴离子交换树脂(或固相)相互 作用或结合。然而，许多杂质的确与阴离子交换树脂相互作用且结合。在一个具体方面，所 述离子交换步骤是阴离子交换色谱法。
[0012] 通过调节样品缓冲液的pH和离子强度，为离子交换色谱法制备亲和色谱洗脱液。 例如，可以在I M Tris缓冲液中调节亲和洗脱液至约4. 5至约8. 5的pH。在将样品（亲和 洗脱液)加载上离子交换柱之前，可以使用合适的缓冲液平衡该柱。合适的缓冲液的一个实 例是Tris/NaCl缓冲液