些培养基中的任何一种都可以根据需要补 加有激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、 钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素药 物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等价 能源。任何其它必需的补充物也可以以本领域技术人员已知的合适浓度包括。培养条件例 如温度、PH等是先前由选择用于表达的宿主细胞使用的那些，并且对于普通技术人员将是 显而易见的。
[0069] 宿主细胞还可以用于产生完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。应当理解 关于上述程序的变化在本发明的范围内。例如，在某些实施方案中，可能希望用编码本发明 抗体的轻链或重链(但并非两者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于去除编码 轻和重链中任一或两者的一些或全部DNA，其并非是对于与IL-13特别是hIL-13结合所必 需的。由这样的截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包含。此外，通过经由标准 化学交联方法使本发明的抗体与第二种抗体交联，可以生产双功能抗体，其中一条重链和 一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重链和轻链对于除IL-13外的抗原是特异性的。
[0070] 在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的合适系统中，通过磷酸钙介导 的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载 体内，抗体重链和轻链基因各自与CMV增强子/ AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱 动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，这允许使用甲氨蝶呤选择/扩增选 择已用载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化体宿主细胞，以允许抗体重链和轻链表达， 并且从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细 胞，选择转化体，培养宿主细胞且从培养基中回收抗体。
[0071] 当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质间隙中产生、或直接分泌到培养基 内。在一个方面，如果抗体在细胞内产生，那么作为第一个步骤，可以例如通过离心或超滤 去除颗粒碎片，或者宿主细胞或者裂解的细胞(例如，起因于匀浆)。当抗体分泌到培养基内 时，来自这样的表达系统的上清液可以首先使用商购可得的蛋白浓缩滤器进行浓缩，例如 Amicon ? 或 Mi llipore Pell icon? 超滤单元。
[0072] 在本发明的方法前，用于从细胞碎片中纯化抗体的程序最初依赖于抗体的表达部 位。一些抗体可以从细胞直接分泌到周围生长培养基内；其它在细胞内制备。对于后面一 种抗体，纯化方法的第一个步骤一般涉及：使细胞裂解，这可以通过多种方法完成，包括机 械剪切、渗压震扰或酶促处理。这样的破坏将细胞的完整内容物释放到匀浆内，并且另外产 生由于其小尺寸难以去除的亚细胞片段。这些一般通过差速离心或通过过滤去除。当抗 体被分泌时，来自这样的表达系统的上清液一般首先使用商购可得的蛋白浓缩滤器进行浓 缩，例如Amicon?或Millipore Pellicon?超滤单元。当抗体被分泌到培养基内时，重组 宿主细胞还可以例如通过切向流过滤与细胞培养基分离。抗体可以使用本发明的抗体纯化 方法从培养基中进一步回收。
[0073] 3. 2.示例性的生产策略 在某些实施方案中，抗-IL-13抗体生产的起始步骤包括：使用自旋烧瓶和Biowave袋 操作，以从单个冷冻瓶繁殖表达抗-IL-13抗体的CHO细胞至希望的生物量，用于接种110 L种子生物反应器。融化原始细胞库CHO细胞的冷冻瓶，并放入生长培养基（SR-512)中， 进行离心。将细胞重新悬浮于生长培养基中，并在37 °C和5% 0)2下在递增体积的一次用 弃的自旋烧瓶、摇瓶和/或Biowave袋中繁殖。使用双份20 L wave袋，使最终细胞团繁殖 最大化，然后接种进种子生物反应器中。当在大约15 - 17天时在2个20 L wave袋中的 细胞密度达到多2. 0 X IO6活细胞/mL时，将培养物转移进装有生长培养基SR-520的110 L种子生物反应器中，用于进一步繁殖。在接种以后，目标温度是37 °C，将目标pH设定为 7. 1，并通过加入NaOH和CO2鼓泡进行控制。通过用空气和氧鼓泡，将生物反应器中的溶解 氧（DO)控制在40%的目标值。在大约2 - 4天以后细胞密度达到彡2.6 X IO6活细胞/mL 后，将培养物转移进3000 L生产生物反应器中。
[0074] 在某些实施方案中，使用3000 L生产生物反应器的部分填充，进一步繁殖细胞培 养物。最初，给该反应器装入生长培养基（SR-520)，并接种来自110 L种子生物反应器的批 次。在该短填充阶段期间，将温度、溶解氧和pH分别控制在37 °C、40%和7.1。通过0)2鼓 泡和NaOH添加，控制培养pH。通常，细胞生长2 - 4天后，达到彡1.6 X IO6活细胞/mL的 生产阶段密度。
[0075] 将生产培养基SR-521 (1950 L)加给在3000 L生物反应器中的细胞培养物，以开 始生产阶段。加入消泡剂C，以减少泡沫。通过开关CO2鼓泡和NaOH添加，将培养pH控制 在6. 9的目标值。将温度和溶解氧分别控制在35 °C和40%的目标值。通过空气鼓泡，并根 据需要补充纯氧，最初将生物反应器中的DO控制在希望的值。在某些实施方案中，当活细 胞密度达到彡3. 0 X IO6细胞/mL时，将温度降低至33 °C的目标值，并分别将pH和DO维 持在6. 9和40%的目标值，而在其它实施方案中，维持35 °C目标值。根据需要，加入葡萄糖 (SR- 334)。当细胞生存下降至< 50%时，如下所述收获和纯化培养物。
[0076] 4.抗体纯化 4. 1 一般抗体纯化 本发明提供了用于从混合物中生产纯化的(或"HCP减少的"）抗体制品的方法，所述混 合物包括抗体和至少一种HCP。本发明也提供了这样的方法，其中最终的纯化的制品含有减 少的漏掉的蛋白A。当抗体已使用上文描述的方法和本领域的常规方法生产时，本发明的纯 化方法从分离步骤开始。表1概括了纯化方案的一个实施方案。设想了该方案的变化，并 且在本发明的范围内，所述变化包括、但不限于这样的变化，其中蛋白A亲和色谱步骤被省 略，或离子交换步骤的次序被颠倒。
[0077] 表1纯化步骤与其相关目的
【主权项】
1. 一种从样品混合物中生产宿主细胞蛋白（HCP)减少的抗-IL-13抗体或其抗原结合 部分制品的方法，所述样品混合物包括抗-IL-13抗体或其抗原结合部分和至少一种HCP， 所述方法包括： (a) 使所述样品混合物接触蛋白A亲和色谱树脂，用包含25 mM TrisUOO mM NaCl、pH 7. 2的缓冲液洗涤所述亲和色谱树脂，随后用包含20 mM柠檬酸钠/柠檬酸、0.5 M NaCl、 pH 6的缓冲液以及然后用包含25 mM Tris、100 mM NaCl，pH 7. 2的缓冲液洗绦，并收集亲 和色谱样品； (b) 将所述亲和色谱样品的pH降低，从而形成pH降低的样品，其中所述pH的降低是约 3的pH至约4的pH ; (c) 调节所述pH降低的样品的pH至约4. 5至约8. 5的pH，使所述调节的pH样品接触 离子交换材料，并收集离子交换样品；和 (d) 使所述离子交换样品接触疏水相互作用色谱（HIC)材料，收集HIC样品，其中所述 HIC样品包括所述HCP减少的抗体或其抗原结合部分制品。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b冲所述pH的降低通过使合适的酸与所述 样品混合物混合来完成，并且其中所述合适的酸选自柠檬酸、醋酸、辛酸和磷酸。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述离子交换材料是阴离子交换材料或阳离子交 换材料。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述离子交换材料是阳离子交换材料。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述阳离子交换材料是阳离子交换树脂，所述阳 离子交换树脂包含选自SCV、羧甲基、磺乙基、磺丙基、磷酸盐和磺酸盐的取代基。
6. 根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中将步骤（c)中所述pH降低的样品的 pH调节至约4. 5至约6. 5的pH。
7. 根据权利要求3所述的方法，其中所述离子交换材料是阴离子交换材料。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述阴离子交换材料是阴离子交换树脂，所述阴 离子交换树脂包含选自二乙氨基乙基（DEAE)、季氨基乙基（QAE)和季胺（Q)基团的取代基。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述阴离子交换材料是Q-琼脂糖。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中所述阴离子交换材料是季胺膜（Q膜)。
11. 根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中将步骤（c)中所述pH降低的样品的 pH调节至约8的pH。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述离子交换步骤包括第一个离子交换步骤和 第二个离子交换步骤。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述HIC材料是HIC树脂。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述HIC树脂包含取代的基质，其中所述取代基 由一种或多种疏水基团组成。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种疏水基团选自烷基、芳基及其 组合。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述基质是苯基取代的琼脂糖树脂。
17. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括过滤步骤，其中对所述HIC样品实施过 滤，以去除病毒颗粒和促进缓冲液更换。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-IL-13抗体或其抗原结合部分是人源化 的抗体、嵌合的抗体或多价抗体。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述抗-IL-13抗体或其抗原结合部分是人源化 的抗体。
20. 根据权利要求1所述的方法，其另外包括深度过滤步骤。
21. 根据权利要求1所述的方法，其中： 将步骤（b)中所述亲和色谱样品的pH降低至pH 3. 5， 将步骤（c)中所述pH降低的样品的pH调节至pH 8,并且所述离子交换材料是Q膜，和 步骤（d)中所述HIC材料是苯基取代的琼脂糖。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中用磷酸将步骤（b)中所述亲和色谱样品的pH降 低至pH 3. 5。
23. -种药物组合物，其包括通过根据权利要求1所述的方法生产的HCP减少的 抗-IL-13抗体或其抗原结合部分制品和药学上可接受的载体。
24. 根据权利要求23所述的药物组合物，其中在权利要求1所述的方法中： 将步骤（b)中所述亲和色谱样品的pH降低至pH 3. 5， 将步骤（c)中所述pH降低的样品的pH调节至pH 8,并且所述离子交换材料是Q膜，和 步骤（d)中所述HIC材料是苯基取代的琼脂糖。
25. 根据权利要求24所述的药物组合物，其中在权利要求1所述的方法的步骤（b)中， 用磷酸将所述亲和色谱样品的PH降低至pH 3. 5。
26. 根据权利要求1所述的方法生产的HCP减少的抗-IL-13抗体或其抗原结合部分制 品。
27. 根据权利要求26所述的HCP减少的抗-IL-13抗体或其抗原结合部分制品，其中在 权利要求1所述的方法中： 将步骤（b)中所述亲和色谱样品的pH降低至pH 3. 5， 将步骤（c)中所述pH降低的样品的pH调节至pH 8,并且所述离子交换材料是Q膜，和 步骤（d)中所述HIC材料是苯基取代的琼脂糖。
28. 根据权利要求27所述的HCP减少的抗-IL-13抗体或其抗原结合部分制品，其中在 权利要求1所述的方法的步骤（b)中，用磷酸将所述亲和色谱样品的pH降低至pH 3. 5。
【专利摘要】本文公开了用于分离和纯化抗-IL-13抗体的方法，其中亲和色谱步骤的使用会产生对于药用而言足够纯的抗体组合物。本文描述的方法包括pH病毒减少/灭活、超滤/渗滤、亲和色谱法（例如，蛋白A亲和色谱法）、离子交换色谱法和疏水色谱法。此外，本发明涉及包含一种或多种本发明的抗体的药物组合物。
【IPC分类】A61P11-06, C07K16-24, C07K1-20, C07K1-22, C07K1-18, A61K39-395
【公开号】CN104744560
【申请号】CN201510208066
【发明人】R.K.希克曼
【申请人】Abbvie 公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2010年10月20日
【公告号】CA2775595A1, CN102711828A, CN102711828B, EP2491055A2, US8491904, US20110206687, US20130287771, WO2011050071A2, WO2011050071A3