抗乙型肝炎病毒x蛋白多肽药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽药物领域，具体涉及含D型氨基酸的抗乙型肝炎病毒X蛋白的多 肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌是导致病人死亡的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，在我国肝癌死亡率仅次于 胃癌，居我国恶性肿瘤死亡率第二位。据统计，我国每年新增肝癌人数30万人，而每年肝癌 死亡人数达11万。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV)感染可导致肝炎、肝硬变和原 发性肝癌的发生，在我国80%以上的肝癌患者为乙肝感染后肝癌，可称之为乙肝后肝癌。
[0003] HBV为长约3.2Kb的DNA病毒，其开放阅读框表达乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg)、乙型肝炎病毒多聚酶和乙型肝炎病毒X抗原 (HBxAg)(或称之为乙型肝炎病毒X蛋白，即HBx)，其中HBx是HBV DNA复制所必须的因子。 由于HBx是HBV DNA复制所必须的因子，因此抑制HBx的功能，意味着可抑制HBV的感染， 以及由此导致的肝炎和肝硬变。
[0004] 另外，HBx作为反式作用因子，促进肝癌的生长和增殖，称之为癌蛋白。在分子水 平、细胞水平和动物水平的研宄也发现，HBx具有很强的促肝癌细胞增殖和迀移的作用。转 基因鼠实验也证明HBx具有显著的促进肝癌发生的作用。大量研宄结果显示，HBV感染的 持续存在可导致慢性肝病，包括慢性肝炎、慢性肝炎反复发作引起的肝组织中纤维结缔组 织增生后发生的肝硬变，及大部分在肝硬变基础上发生的肝癌。在慢性肝病（包括肝炎、肝 硬变和肝癌）的发生发展过程中，HBx发挥了重要的作用。因此，HBx是预防和治疗肝病的 重要靶点。
[0005]目前，肝癌的治疗以手术为主，辅以介入疗法，而化疗效果不理想。在临床手术的 肝癌组织中HBsAg和HBxAg的表达阳性检出率高达80%甚至90%以上。因此，HBx作为肝 癌发生发展的重要致病因子，而发现其特异性抑制剂，则具有重要的理论意义和实际临床 应用价值。然而，由于目前HBx的三维构象解析尚未完成，故难以通过HBx立体三维构象设 计其化学抑制剂。
[0006] 多肽片段可作为药物，其在临床上已广为应用。例如，胸腺肽（thymopeptide)是 从小牛胸腺中提取的胸腺五肽，具有促进淋巴细胞转化、增强巨噬细胞吞噬活性的作用，可 用于治疗多种免疫缺陷病。多肽药物的特点是药理作用明确，安全性高，并易于生产。但是， 多肽药物的药效通常并不理想，因其在生物体内易受蛋白酶的影响而降解，稳定度低、半衰 期短。
[0007] 氨基酸可以左旋（"L型氨基酸"）或右旋（"D型氨基酸"）的构象存在。在人体 或动物体内构成蛋白质的天然氨基酸全部都是L型的，并没有D型氨基酸。机体中缺乏作用 于D型氨基酸的蛋白水解酶。因此，在生成多肽药物时，如果将多肽链上的天然氨基酸由L 型替换为D型，即使在不改变氨基酸序列的情况下，也能提高多肽药物在血液中的稳定性。 但是如何在提高多肽药物抗降解的同时，不破坏其结合特性，从而保留药效，仍然是困扰着 多肽药物开发的大问题。
[0008] 本发明的发明人曾经发现了一种具有抑制乙型肝炎病毒X蛋白（h印atitis B virus X protein，HBx)功能的、且均由天然L型氨基酸组成的多肽（详见中国国家发明专 利号ZL201110061840. 5,其公开内容以全文引用的方式并入于此）。该多肽包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。该多肽在分子水平、细胞水平和动物水平上具有抑制HBx活性的 作用，可用于预防和治疗抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝炎、肝硬变和肝癌。
【发明内容】
[0009] 本发明涉及一种抗乙型肝炎病毒X蛋白的多肽及其应用。所述多肽为包含D型氨 基酸的多肽，其具有抑制乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx)功能， 可在分子水平、细胞水平和动物水平上具有抑制HBx活性，抑制乙型肝炎病毒DNA的复制和 相关抗原（如HBeAg)的表达，并进而抑制乙型肝炎病毒感染所造成的肝炎、肝硬变，以及在 肝硬变基础上发生肝癌。
[0010] 一方面，本发明提供了分离的多肽，其包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或其 功能片段、或者所述氨基酸序列及其功能片段的功能变体，并且所述氨基酸序列、所述功能 片段、或所述功能变体的氨基酸序列中的一个或多个L型氨基酸被D型氨基酸所取代，所述 多肽具有抑制乙型肝炎病毒X蛋白的功能，并能抑制乙型肝炎病毒感染后的慢性肝病的发 生和发展。
[0011] 优选地，本发明的所述多肽的氨基酸序列具有与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列 至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、99%或更高）的相同性。
[0012] 在本发明的一些具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NOs :2-11所 示的氨基酸序列中的任一种。
[0013] 在本发明中，所述乙肝病毒感染后的慢性肝病包括肝炎、肝硬变和肝癌。
[0014] 另一方面，本发明提供了所述多肽在制造抗乙肝病毒感染后的慢性肝病的药物中 的应用。具体来说，所述药物可为乙肝的治疗性疫苗。所述药物可以为包含本发明任一种 多肽的药物组合物，其可以包含任选的药物载体。
[0015] 和具有相同氨基酸序列但全部由L型氨基酸组成的多肽相比，本发明的多肽不单 具有良好的稳定性，更有着令人惊异的显著药学效果，对乙型肝炎病毒DNA的复制和相关 抗原（如HBeAg)的表达的抑制效果尤其明显。所述多肽因此可广泛用于防治乙型肝炎病 毒感染所引发的慢性肝病，包括肝炎、肝硬变和肝癌。
【附图说明】
[0016] 图1.应用高压液相色谱（HPLC)对纯化后人工合成多肽D-TTK001的分析结果。
[0017] 图2.应用Biacore 3000检测本发明的多肽与靶蛋白HBx的体外结合力的实验结 果。
[0018] 图3.检测本发明的多肽在细胞水平对整合HBV DNA肝癌HepAD38细胞分泌 HBeAg水平的影响。结果显示，分别应用人工合成的0. 1、1、10和100 μ M多肽D-TTK001和 L-TTK001 (即anti-HBxPl#)作用48小时后，对整合HBV DNA肝癌H印AD38细胞分泌的HBeAg 水平均具有抑制作用，呈剂量依赖性。D-TTK001的最低有效剂量为0.1 yM ;L-TTK00