oli ATCC25922)、标准菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)以及临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)0具体操作如下:
选取单菌落接种于营养肉汤培养基中，过夜振摇培养(37°C，180rpm)，将50 μ L过夜培养菌液接种于5mL肉汤培养基中，振摇培养4小时。培养好的菌悬液稀释1000倍，取100 μ L加入MH平板培养基表面，涂布均匀。在涂布好菌液的平板培养基表面均匀贴上直径为5mm的圆形滤纸片，滤纸片上加1yL待测样品。将加完样品的平板倒置于37°C恒温培养箱中培养24小时，用卡尺测量抑菌圈直径，单位为_。实验结果如图4所示。由图4可知，A组加有抗菌肽样品的滤纸片周围无抑菌圈出现，说明本发明所述抗菌肽对大肠杆菌无抑制作用。B组和C组加有抗菌肽样品的滤纸片周围出现明显的抑菌圈，表明本发明所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌以及耐药金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用。
[0020]采用液体生长抑制法检测本发明所述抗菌肽对细菌的抑制活力
本实例所用抗菌肽由上海吉尔生化有限公司根据序列SEQ ID N0.1合成，纯度为95%。
[0021]将上述菌株挑单菌落接种于LB培养基中，37°C培养过夜，稀释菌液使菌浓度达到2X 15 CFU/mL。将稀释好浓度的菌液50 μ L以及按一定比例稀释后的多肽50 μ L加入96孔培养板中，混合均匀。将96孔板置于37°C培养18 h后，酶标仪检测600 nm波长的吸光值。结果见图7。
[0022]检测不到细菌生长的最低多肽浓度为最小抑制浓度。计算原则:取刚好检测不到细菌生长的孔和与其相邻的并有细菌生长的孔，二者浓度的平均值即为最小抑菌浓度(MIC,定义为显著抑制细菌生长的最低浓度)。
[0023]由检测结果可知，该抗菌肽对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的最小抑菌浓度均达到微克级，具有极强的抑菌活性。
[0024]MTT法检测本发明所述抗菌肽对乳腺癌细胞MCF-7生长的抑制作用。
[0025]本实施例所用抗菌肽由上海吉尔生化有限公司根据序列SEQ ID N0.1合成，纯度为95%。具体操作如下:
乳腺癌细胞MCF-7培养于含有10%热灭活胎牛血清，链霉素和青霉素各100U/mL的MEM培养基中。
[0026]收集对数期细胞，将细胞浓度稀释为5 X 14个/mL。细胞铺板，每孔100 μ L，细胞数为5000个/孔。置于37°C二氧化碳培养箱中培养12h。
[0027]用含有不同浓度抗菌肽的100 μ L培养基继续培养细胞24 h后，然后在避光的条件下每孔加入1yL MTT (5mg/mL)，孵育4 h。
[0028]弃掉培养基，将10yL DMSO加入96孔板中，溶解结晶。37 °C，80 rpm，摇床孵育20 min，至结晶充分溶解。
[0029]酶标仪检测535nm吸光值。抑制率计算如下:
抑制率％=〔 1-(样品吸光值-空白吸光值)/ (阴性对照吸光值-空白吸光值)〕X 100%结果显示，当抗菌肽浓度为5 μ g/mL时，对MCF-7的抑制率为6.3%，其他浓度时对癌细胞的抑制率分别为 7.6%、9.6%、13.8%,20.6%,32.5%,50.7%,73.4% 和 75.8% (如图 5 所示)。
[0030]从以上结果可以看出，本发明所述抗菌肽对人乳腺癌细胞MCF-7具有生长抑制作用，且有量效关系。
[0031]序列表
〈110〉中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研宄所 〈120) 一种从林蛙皮肤分泌物中分离的抗菌肽及其制备方法 〈160〉 I
〈170〉PatentIn Vers1n 2.1〈210〉 I〈211〉 14〈212〉 PRT
〈213〉中国林娃(Rana chensinensis)
〈220〉
〈221〉 PEPTIDE，DISULFID〈221〉 (I)…(14)， (8)…(14)
〈223〉
〈400〉 Phe Leu Pro Phe Phe Ala Ala Cys Ala He Thr Lys Lys Cys
I510
【主权项】
1.一种从林蛙皮肤分泌物中分离的抗菌肽，其特征是:其氨基酸序列为SEQ ID N0.1:Phe-Leu-Pro-Phe-Phe-Ala-Ala-Cys-Ala-1le-Thr-Lys-Lys-Cys,分子量为 1556.8 道尔顿。
2.一种从林蛙皮肤分泌物中分离的抗菌肽的制备方法，其制备方法是: O提取皮肤分泌物:采用8-10厘米长的活体林蛙，用超纯水清洗干净，酒精棉擦拭后放在洁净的玻璃平皿上；用10伏稳压间断性的多点刺激蛙的耳后腺及背部，待观察到皮肤出现大量分泌液，用超纯水将分泌液冲洗下来，将这些分泌液收集，放在_70°C备用，即为林蛙皮肤分泌物粗提物； 2)分离纯化:取皮肤分泌物粗提物超速离心过滤后收集滤液；滤液通过C18半制备柱进行液相色谱分离；检测波长217nm，溶液A为含0.025%三氟乙酸的水溶液，溶液B为含0.025%三氟乙酸的乙腈溶液；色谱柱使用前用溶液A平衡，柱子平衡后将滤液加到柱子上，上样量2mL/次，流速2mL/min，然后以梯度10%_60%加入溶液B，持续56min，收集具有最佳抗菌活性的峰；利用反相高效液相色谱对其进一步分离；采用C18分析柱，溶液Al组分为含0.1%三氟乙酸的水溶液，溶液BI组分为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；用前，柱子用溶液Al平衡，然后以lmL/min的流速将样品加到柱子上，以梯度10%_40%加入溶液BI，持续时间25min，再以梯度40%_60%加入溶液BI，持续时间45min，收集第4个峰的洗脱液，冷冻干燥即为所述抗菌肽。
3.如权利要求所述的一种从林蛙皮肤分泌物中分离的抗菌肽，其特征是:抗菌肽氨基酸序列第8和14位之间形成一个二硫键。
【专利摘要】一种从林蛙皮肤分泌物中分离的抗菌肽及其制备方法，属于生物医学和生物技术领域，其特征是：其氨基酸序列为SEQ ID No.1：Phe-Leu-Pro-Phe-Phe-Ala-Ala-Cys-Ala-Ile-Thr-Lys-Lys-Cys，分子量为1556.8道尔顿。其制备方法是：1）提取皮肤分泌物：采用活体林蛙，用10伏稳压间断性刺激蛙的耳后腺及背部，分泌液收集，备用；2）分离纯化：超速离心过滤收集滤液。进行液相色谱分离。溶液A为三氟乙酸，溶液B为三氟乙酸；色谱柱使用前用溶液A平衡，柱子平衡后将滤液加到柱子上，上样量2mL/次，然后加入溶液B，收集具有最佳抗菌活性的峰。利用反相高效液相色谱对其进一步分离。有益效果是：对大肠杆菌和葡萄球菌具有较强抗性，而且对于临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也具有抑制作用。本发明的抗菌肽对MRSA具有抑制作用，由于其抗菌机制的特殊性，不会产生耐药性，可成为抗临床耐药菌株乃至超级细菌的新型抗菌药物。
【IPC分类】A61P35-00, A61P31-04, C07K7-08, C07K1-20
【公开号】CN104744566
【申请号】CN201510162430
【发明人】李吉平, 李楠, 王承宇, 刘全, 郝镯, 侯峰, 王雅丽, 潘鹏鹏
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月8日