使用纤维素和纤维素结合域从植物中分离并纯化蛋白质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用不同结构的纤维素和/或其变体分离含有纤维素结合域的 蛋白质的方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素是构成细胞膜和木质部的基本成分，并且是在植物中含量约大于等于30% 的一类有机化合物。纤维素是一种多糖，其化学结构由多个通过0 -1，4糖苷键连接的D-葡 萄糖单元组成，并且在自然状态下，分子量为数万到数十万。纤维素是白色无味固体，不溶 于水、乙醇和乙醚，对于碱具有很强的抗性。然而，纤维素在酸中或铜铵液中水解，从而产生 大量的作为中间产物的纤维二糖，并最终转化为葡萄糖。由于纤维素是自然界中最丰富的 天然资源之一，所以进行了许多利用纤维素的研宄。
[0003]同时，分解纤维素的纤维素酶具有纤维素结合域（CBD)，并由此特异性地与纤维素 结合以有效分解纤维素。研宄人员已经做出了各种各样的尝试，通过使这样的纤维素结合 域与靶蛋白结合来制备特异性结合纤维素的重组蛋白（韩国专利号10-0618563)。然而，这 些尝试仅限于使用微生物制备重组蛋白的方法，但是使用植物的例子尚未被报道。
[0004] 然而，最近，由于注意力集中在制备植物来源的重组蛋白或疫苗，迫切需要开发使 用植物制备大量重组蛋白的方法，及低成本快速分离大量高纯度的重组蛋白的方法。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明的目的在于解决传统的技术问题，因此其涉及提供一种使用不同结构的纤 维素和/或其变体分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法，以快速简单地分离在植物中大 量表达的蛋白质。
[0007] 然而，本发明完成的技术目的并不限于上述目的，本领域普通技术人员从以下的 说明中应当清楚地理解本发明的其它目的。
[0008] 技术方案
[0009] 本发明的一方面在于提供一种分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法，其包括：
[0010] (a)蛋白质结合步骤，其中，混合含有蛋白质的植物提取物和纤维素；
[0011] (b)洗涤步骤，其中，除去未结合的蛋白质；和
[0012] (c)洗脱步骤，其中，洗脱与纤维素结合的蛋白质。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，纤维素可以是微晶纤维素或无定形纤维素。
[0014] 在本发明的另一个实施方案中，微晶纤维素的使用量可以是植物提取物的0. 5~ 2倍。
[0015] 在本发明的还一实施方案中，无定形纤维素的使用量可以是植物提取物的0. 1~ 0? 5 倍。
[0016] 在本发明的还一实施方案中，无定形纤维素可以通过以下方法制备，该方法包括： (a)通过将微晶纤维素添加到40~75%的磷酸中并搅拌混合物制备无定形纤维素；并且
[0017] (b)向无定形纤维素中添加500mM~1. 5M的碳酸钠。
[0018] 在本发明的还一实施方案中，含有纤维素结合域的蛋白质可能含有由SEQ. ID. N0:2表示的纤维素结合域的氨基酸序列。
[0019] 在本发明的还一实施方案中，在蛋白质的结合步骤中，可以使用含有10~60mM醋 酸钠、10~200mM氯化钠和0. 1~3mM氯化钙的缓冲液。
[0020] 在本发明的还一实施方案中，在洗涤步骤中，可以使用含有10~60mM醋酸钠、 10~200mM氯化钠、0. 1~3mM氯化钙和0. 05~0. 2%的Triton X-100的缓冲液。
[0021] 在本发明的还一实施方案中，在洗脱步骤中，可以使用含有pH值为7. 5~10的 10~60禮1^8-11(：1缓冲液、10~2001111氯化钠、0.1~31111氯化钙和1~20%纤维二糖 的缓冲液。
[0022] 有益效果
[0023] 根据本发明的分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法，由于纤维素作为亲和基质 使用，与常规亲和基质相比，制备方法能够以低成本实现，并且在分离中使用的试剂的含量 根据纤维素的种类可以降低。因此，可显著降低分离蛋白质的成本，并能够分离大量蛋白 质。此外，由于使用了对于纤维素具有高亲和性的纤维素结合域，通过阻止蛋白质的非特异 性结合，可以从总的植物体的提取物中快速分离高纯度蛋白，且低浓度的蛋白质也可以被 分离，其中总的植物体的提取物中混合有各种蛋白质。
【附图说明】
[0024] 图1示出了用于从植物提取物中分离和纯化蛋白质的无定形纤维素的有效制备 的图示。
[0025] 图2示出了使用微晶纤维素分离的蛋白质的免疫印迹的结果。
[0026] 图3示出了使用无定形纤维素分离的蛋白质的免疫印迹的结果。
[0027] 图4示出了使用无定形纤维素分离的蛋白质，其在SDS-PAGE中通过考马斯亮蓝染 色进行鉴定。
【具体实施方式】
[0028] 本发明提供了一种分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法，该方法包括以下步 骤：
[0029] (a)蛋白质结合步骤，其中，混合含有蛋白质的植物提取物和纤维素；
[0030] (b)洗涤步骤，其中，除去未结合的蛋白质；和
[0031] (c)洗脱步骤，其中，洗脱与纤维素结合的蛋白质。
[0032] 经研宄，本发明人找到了一种以低成本从植物体中快速分离大量高纯度重组蛋白 的方法，完成了本发明。也就是，在本发明的一个示例性的实施方案中，值得指出的是通过 使纤维素结合域（CBD)与编码靶蛋白的基因的3'端结合来制备重组载体，该纤维素结合域 由SEQ. ID. NO: 1的碱基序列或者SEQ. ID. N0:2的氨基酸序列组成，使用该重组载体制备了 产生靶蛋白的转基因植物体，并且使用微晶纤维素（MCC)和/或无定形纤维素（AMC)分离 靶蛋白（参见实施例1至3)。
[0033] 如上所述，本发明人认识到使用纤维素，靶蛋白能够容易地从植物体中洗脱，该植 物体表达含有纤维素结合域的靶蛋白。
[0034] 因此，本发明可以提供一种分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法。
[0035] 更特别地，在本发明中，纤维素可以是微晶纤维素或无定形纤维素。此处，微晶纤 维素的使用量可以是植物提取物的〇. 5~2倍，优选地，与植物提取物的使用量相同。无定 形纤维素的使用量可以是植物提取物的〇. 1~〇. 5倍，但是本发明不限于此，上述使用量可 以根据条件，例如，靶蛋白的表达程度进行调整。
[0036] 此外，可以通过将微晶纤维素添加到40~75 %的磷酸中并搅拌混合物制备无定 形纤维素，并向无定形纤维素中添加500mM~1. 5M的碳酸钠，但本发明不限于此。
[0037] 在本发明中，含有纤维素结合域的靶蛋白可以是由SEQ.ID. N0:2表示的纤维素结 合域的氨基酸序列或与上述氨基酸序列具有基本上相同活性的序列组成的重组蛋白。
[0038] 此处，"基本上相同活性"意味着纤维素结合域的活性，并且可包括氨基酸序列变 体，其功能上与原始的序列相同，但是含有取代、缺失或添加的部分。
[0039] 在根据本发明的分离含有纤维素结合域的蛋白质的方法中，可以使用含有10~ 60mM醋酸钠（NaOAC)、10~200mM氯化钠（NaCl)和0. 1~3mM氯化钙（CaC12)的缓冲液进 行蛋白质结合步骤，优选地，缓冲液含有50mM醋酸钠、50mM氯化钠和ImM氯化钙。
[0040] 此外，可以使用含有10~60禮醋酸钠（恥(^〇、10~2001111氯化钠（恥(：1)、0.1~ 3mM氯化钙（CaC12)和0. 05~0. 2 %的Triton X-100的缓冲液进行洗涤步骤，优选地，缓 冲液含有50mM醋酸钠、50mM氯化钠、ImM氯化钙和0. 1% Triton X-100。
[0041] 此外，此处可以使用含有pH值为7. 5~10的10~60mM Tris-HCl缓冲液、10~ 2001111的氯化钠（似(：1)、0.1~31111的氯化钙化&(：12)和1~20%纤维二糖的缓冲液进行 洗脱步骤，优选地，缓冲液含有pH值为8. 8的50mM的Tris-HCl缓冲液、50mM氯化钠、ImM 氯化钙和1%纤维二糖。
[0042] 本文使用的术语"靶蛋白（或蛋白质）"是指一种根据本发明的由基因工程的方法 制备的蛋白质，但本发明不特定地限于一种蛋白质。靶蛋白可以包括能够用在商业应用中 并需要大量制备的蛋白质。
[0043] 下文中，为了帮助理解本发明，将对示例性的实施例进行描述。然而，简单地提供 了示例性的实施方案使得本发明更容易被理解，但是本发明的范围不限于以下示例性的实 施例。
[0044] 具体实施例
[0045] 实施例1.转基闵棺物体的制各
[0046] 为了制备表达靶蛋白的转基因植物体，通过使纤维素结合域（CBD)结合到编码靶 蛋白（猪霍乱病毒糖蛋白gp55)的基因的3'端，将基因插入到植物表达载体pCAMBIA 1300 中制备重组载体，该纤维素结合域由SEQ. ID. NO: 1的碱基序列或者SEQ. ID. NO:2的氨基酸 序列组成，将载体转化到根癌农杆菌（Agrobac