，可见菌落为淡黄色，菌落表面光滑，边缘整 齐，不透明，菌液粘稠（见图1)。革兰氏染色为阴性。电子显微镜观察表明，菌体呈短杆状 (见图2)。生化反应证明其培养基内可以产气，可水解卵磷脂、凝胶和脂质，不能水解尿素， 鼠李糖培养可产酸，柠檬酸培养不产酸，〇°C下不生长等。
[0036] (2) YM8的分子生物学鉴定
[0037] 将YM8菌株于NB培养液（牛肉膏3. Og/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5. Og/L，补充蒸 馏水至1L;调pH至7. 2)中摇培48h后收集菌体，米用10mM的tris-HCl (购自Amresco公 司产品）和ImM的EDTA提取基因组DNA(de Silva et al. 1998)，提取后用苯酚-氯仿-异 戊醇（25:24:1)抽提和TER溶解。利用特异性引物扩增16s rDNA并送深圳华大公司进行 测序。测序序列长度为1508bp，具体序列如SEQ ID N0. :1所示。
[0038] 测序引物的DNA序列：
[0039] 16S rDNA(正向引物）：AGAGITTGATCCTGGCTC
[0040] 1防rDNA(反向引物）：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
[0041] 在Genbank数据库中，将YM8菌株的16s rDNA序列进行BLAST检索，发现其与希 瓦氏菌属内不同种的细菌菌株相似度较高，为进一步确定该菌株的遗传特性，选取比对结 果中同源性较高的菌株构建系统发育树。
[0042]根据其形态和生化特征，以及16S rDNA基因序列系统发育分析（图3)，经鉴定本 发明所分离的菌株是一株海藻希瓦氏菌（Shewanella algae)，申请人将该菌株命名为海藻 希瓦氏菌YM8，Shewanella algae YM8,于2015年3月17日将该菌株送交中国.武汉.武 汉大学中国典型微生物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC N0:M 2015120。
[0043] 实施例2海藻希瓦氏菌YM8对黄曲霉的抑菌作用
[0044] 筛选菌株YM8对黄曲霉菌丝生长的抑制作用采用培养皿（直径9cm)对扣的方式 中进行。其中黄曲霉于PDB培养基（去皮马铃薯200. 0g沸水煮20min后纱布过滤收集滤 液，添加葡萄糖20. 0g，蒸馏水定容至1L，自然pH，即不调pH)培养三天后，挑取白色的菌丝 团，接种于含？〇4的培养皿中央。菌株￥118(100^1，10 8〇包/1111)涂布于另一个含嫩培养基 的培养皿表面。将接种黄曲霉菌丝块的培养皿对扣于涂布YM8的培养皿之上，透明胶带封 口保存。以仅接种黄曲霉菌丝块的处理作为对照，每个处理有3个重复，28°C黑暗条件下培 养5天后计算不同处理的菌丝直径并计算抑菌率。
[0045] 抑菌率的计算公式如下：
[0046] 菌丝生长抑菌率=(对照菌丝直径-处理菌丝直径）/对照菌丝直径X 100 %。
[0047] 菌株YM8对黄曲霉孢子萌发的抑制作用采用培养皿对扣培养法，100 y 1黄曲霉孢 子（5 X 105cfu/ml)涂布于含PDA培养基的平皿表面，菌株YM8(100y 1，108cfu/ml)涂布于 含NA培养基的培养皿表面。将接种黄曲霉孢子液的培养皿对扣于接种YM8菌液的培养皿 之上，以仅接种黄曲霉孢子的处理作为对照，透明胶带封口保存。28°C黑暗条件下培养1天 后显微镜观察，记录孢子萌发个数，以萌发产生的菌丝长度大于孢子直径的作为已萌发。计 算不同处理的孢子萌发率，并计算YM8对孢子萌发的抑制率。
[0048] 计算公式如下：
[0049] 孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率 X 100%〇
[0050] 海藻希瓦氏菌YM8与黄曲霉菌丝在密封培养皿内无接触培养过程中，可以产生挥 发性的气体物质，完全抑制黄曲霉菌丝的生长，YM8对菌丝生长抑菌率达100% (图4)。海藻 希瓦氏菌YM8在与菌丝的共培养过程中，通过产生抑菌气体物质可完全抑制孢子的萌发， 当培养12h后，对照组的孢子已萌发长出菌丝，但YM8处理组的孢子未见萌发（图5)。继续 培养48h后，对照组萌发的菌丝形成菌丝团，覆盖培养基的的表面，YM8处理组仍未见孢子 萌发。YM8对孢子萌发的抑菌率达100% (图4)。
[0051] 实施例3活性炭对海藻希瓦氏菌YM8抑菌作用的影响
[0052] 鉴于活性炭作为一种挥发性物质的吸附剂，我们将活性炭添加到菌株YM8与黄曲 霉的共培养试验中。方法是，中间有分隔的9cm培养皿的一端添加5g活性炭，另一端涂布 YM8菌液（50 y 1，108cfu/ml)，黄曲霉的菌丝块接种于另一个含有PDA培养基的培养皿中 央。将接种黄曲霉菌丝块的培养皿倒置扣于添加活性炭和YM8的培养皿之上。试验中采用 如下所述的四个处理：（1):黄曲霉菌丝块；（2)黄曲霉菌丝块+活性炭；(3)黄曲霉菌丝块 +YM8 ; (4)黄曲霉菌丝块+活性炭+YM8。每个处理设置3个重复，封口后于28°C黑暗条件 下培养5天后，检测菌丝直径并计算抑菌率。
[0053] 共培养5天后检测，对照组黄曲霉菌丝直径达5. 37cm，添加活性炭后菌丝直径为 5. 35cm，二者无显著差异，说明活性炭对黄曲霉菌丝的生长无抑制作用。黄曲霉与YM8共培 养5天后菌丝直径为0cm，但体系中添加活性炭后菌丝直径为3. 20cm，表明YM8密闭体系中 可以产生挥发性的气体物质，并抑制黄曲霉的生长，当代谢产物达到一定浓度时，抑菌率达 到100%，但反应体系中添加活性炭，作为挥发性物质吸附剂，可以减少有效物质的浓度，降 低了对黄曲霉的抑制率（图6)。试验表明YM8产生的抑菌气体物质是抑制黄曲霉生长的关 键因素，而并非其他生防机制（如竞争空间，氧气等）。
[0054] 实施例4海藻希瓦氏菌YM8挥发性气体检测
[0055] 将菌株YM8接种于100ml三角瓶中的NA培养基表面，涂布均匀。瓶口用双层塑料 薄膜封闭，以不接种YM8的三角瓶作为对照，所有三角瓶置于28°C黑暗条件下培养48h。培 养后的三角瓶转移到40°C的水浴锅中平衡30min。之后依次进行样品的萃取和GC-MS检测。
[0056] 样品萃取方法：
[0057] 采用固相微萃取柱（SPME)进行挥发性物质的富集。将SPME的萃取头插入塑料薄 膜之内，推出纤维头，使纤维头处于样品瓶上空的中间位置，吸附30min。将纤维头收回萃取 头，并拔出样品瓶后转入气相色谱质谱联用仪（GC-MS)进样检测，检测参数设计如下。
[0058] GC 条件：
[0059] 进样口温度为250°C;载气为氦气，柱流速lmL/min;不分流进样。程序升温条件： 起始温度为40°C，保持3min后，以3°C /min的速度升温至160°C，同样保持2min，再以8°C / min 速率升至 220°C，保持 3min。J&WHP - 5MS 弹性石英毛细管柱（30mX0. 25mm ID，0. 25um thickness film)〇
[0060] MS 条件：
[0061] 离子源温度为230 °C，四极杆温度150 °C，电离方式：El源，能量为70eV，采用 全扫描的模式进行检测，检测范围为50-550amu。检测物质自动进行谱库检索National Institure of Standards and Technology(NIST 08)，对检测的物质进行定性。
[0062] GC-MS检测后，YM8培养试剂瓶检测到的物质，扣除NA培养基对照组中检测到的气 体物质，即为YM8产生的挥发性气体组分。试验中YM8共计检出15种物质（图7)，如表1 所示。15种物质中含有芳香族化合物，烷类化合物，硫化物，烯醇类，噁唑类，蒽类，酯类以及 酚类物质等。鉴定出的物质是分子量介于97-342道尔顿（D)之间的小分子物质，易于挥发。 其中组分4 (二甲基三硫）是丰度最高的产物，相对峰面积达14. 195%，其他物质丰度相对 较低。为研宄15种产物中主要的抑菌成分，我们将相对丰度在0.5%以上，NIST 08谱库比 对相似度高于70%的六种物质购买了标准品，以进行后续的抑菌试验。六种物质的编号和 名称分别为2 (壬烷），4 (二甲基三硫），5 (2-十二烷醇），10 (2,4-二甲基噁唑），14 ( 丁基 羟基甲苯），15(2, 4-二叔丁基苯酚）（图7)。
[0063] 表1 GC-MS检测YM8代谢产物
【主权项】
1. 一株对黄曲霉菌及毒素具有高效抑制作用的海藻希瓦氏菌（Shewanellaalgae) YM8,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2015120。
2. 如权利要求1所述的菌株，其特征在于，该菌株的16SrDNA的核苷酸序列如序列表 SEQIDNO:1 所示。
3. -种防治黄曲霉菌侵染及毒素产生的海藻希瓦氏菌的代谢产物的鉴定，其特征在于 所述的海藻希瓦氏菌（Shewanellaalgae)YM8产生的挥发性代谢物质具有抑菌作用。
4. 如权利要求1或2所述的菌株在防治仓储期不同水活度下花生和玉米黄曲霉菌和毒 素的中的应用。
5. 权利要求1或2所述的菌株在制备防治作物储藏期霉菌和毒素制剂中的应用。
【专利摘要】本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及防治作物储藏期黄曲霉菌及毒素的海藻希瓦氏菌及其应用。本发明包含了该海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)YM8的鉴定、以及广谱和广温范围内的抑菌作用，同时鉴定了该菌株产生的抑菌气体代谢产物，并进行了抑菌活性分析等。本发明分离的海藻希瓦氏菌YM8保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2015120。本发明还检测了不同水活度的仓储环境下，该菌株YM8在抑制花生与玉米黄曲霉病害与毒素污染中的应用。CCTCC NO：M 201512020150317
【IPC分类】C12R1-01, C12N1-20, A23B9-28, C12Q1-18
【公开号】CN104762230
【申请号】CN201510133782
【发明人】廖玉才, 宫安东, 李和平, 张静柏
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月26日