闹羊花分离的二萜类化合物的抗肿瘤药物及方法用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然提取物药物化学技术领域，特别涉及一种闹羊花分离的二萜类化 合物的抗肿瘤药物及方法用途。
【背景技术】
[0002] 羊掷躅（RhododendronmolleG.Don)为杜花科植物，分布于我国长江流域至南 部各地，生长于山坡、灌丛或草丛中。羊踯躅的花、果实和根等均可供药用。花一般称闹羊 花，味辛，温，有大毒，入肝经；具有定痛、驱风和除湿等功效，用于风湿顽痹，伤折疼痛，皮肤 顽癣。果实一般称六轴子或八里麻，味苦，温，有大毒，入肺、脾经；具有搜风止痛、止咳平喘 等功效，用于风寒湿痹，跌打损伤，咳喘。根味辛，温，有毒，入脾经；具有祛风、止咳、散瘀和 止痛等功效，用于风寒湿痹，跌打损伤，痔漏，癣疮。化学研宄表明，二萜和黄酮类化合物是 羊踯躅花、果实和根等的主要成分，其中二萜类成分既是主要有效成分，也是其毒性成分。
[0003] 目前从羊踯躅的花、果实和根中分离得到并经结构确证的二萜类成分根据母 核主要分为两大类：grayanane型和kalmanol型。Grayanane型代表性化合物包括： rhodomolleinXVI、rhodomolleinXVII、rhodomolleinXVIII、rhodojaponinIII、 rhodojaponinVI(DiterpenoidsfromtheFruitsofRhododendronmolle?J.Nat. Prod. 2000,63，1214_1217);rhodomosideA和rhodomosideB(DiterpenoidandPhenolic GlycosidesfromtherootsofRhododendronmolle)；rhodomolleinIX、rhodomollein X、rhodomolleinXI、rhodomolleinXII和rhodomolleinXIII(Diterpenoidsfromthe FlowersofRhododendronmolle，J.Nat.Prod. 2004,67,1903-1906);rhodomolinA和 rhodomolinB(GrayananeDiterpenoidsfromtheFlowersofRhododendronmollewith CytotoxicActivityagainstaSpodopterafrugiperdaCellLine，J.Nat.Prod. 2005， 68,924-926) ;seco-rhodomo1lone(DiterpenoidsfromtheFlowersofRhododendron molle，J.Nat.Prod. 2014, 77,1185-1192)。Kalmanol型代表性化合物包括：rhodomollein XV、kalmanol(DiterpenoidsfromtheFruitsofRhododendronmolle，J.Nat. Prod. 2000,63,1214-1217)和rhodomolleinXIV(DiterpenoidsfromtheFlowersof Rhododendronmolle，J.Nat.Prod. 2004,67,1903-1906)。代表性Grayanane型和kalmanol 型二萜化合物结构分别如图1和图2所示。
[0004] 闹羊花为羊踯躅的干燥花，具有祛风除湿、散瘀定痛之功效，可用于风湿痹痛、偏 正头痛、跌扑肿痛、顽癣[中华人民共和国药典（一部）[S]，2010版]。其化学成分研究始 于二十世纪八十年代，研究内容主要集中于其二砲类化学成分^Grayanane型和kalmanol 型二萜类化合物主要通过液液萃取和不同类型填料的柱色谱法分离纯化得到。典型的方法 为：第一步，不同浓度的醇溶液提取；第二步，提取物分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯 和正丁醇萃取，分成不同极性段；第三步，取二萜类化合物集中的乙酸乙酯萃取物用正相硅 胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、MCI微孔树脂柱色谱或者凝胶柱色谱细分纯化。
[0005] 闹羊花中二萜类成分药理活性筛选的报道较少，细胞毒活性研究更少。2005年， Zhong等报道了闹羊花中两个Grayanane型化合物rhodomolinsA和rhodomolinsB对斜 纹夜蛾细胞系Sf_9 的细胞毒作用，IC50 值在 12-80yg/mL(GrayananeDiterpenoidsfrom theFlowersofRhododendronmollewithCytotoxicActivityagainstaSpodoptera frugiperdaCellLine，J.Nat.Prod.2005,68,924_926)。目前尚未见闹羊花中kalmanol 型二萜成分的活性报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于，在针对闹羊花有效成分研宄中，从乙酸乙酯萃 取物中分离鉴定了一个新的kalmanol型二猫化合物，化学结构上为rhodomolleinXXIV5 位羟基和1位氢脱水产物，为首次报道，命名为kalmanene。细胞毒试验表明，该化合物对肿 瘤细胞具有显著的细胞毒作用，对正常细胞细胞毒作用相对较弱，可以作为制备抗肿瘤药 物的活性成分。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种闹羊花中分离的二萜类化合物，所述二 猫类化合物为kalmanol型二猫化合物，化学结构上为rhodomolleinXXIV5位羟基和1位 氢脱水产物。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明还提供了 一种闹羊花中分离的二萜类化合物，所述 二萜类化合物的制备方法包括：
[0009] 取闹羊花，用二氯甲烷提取三次脱脂，过滤，收集滤渣；
[0010] 将滤渣用乙醇溶液提取三次，过滤，收集滤液，减压浓缩得乙醇提取物；
[0011] 将乙醇提取物加水制成提取物水悬液，以石油醚萃取三次再次脱脂后，以乙酸乙 酯萃取三次，获得的乙酸乙酯萃取液浓缩，再以饱和碳酸氢钠水溶液萃取三次，取乙酸乙酯 相蒸干，获得乙酸乙酯萃取物粗品；
[0012] 将粗品在硅胶上进行柱层析，用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱，获得乙酸乙酯-乙醇洗 脱物，浓缩得浸膏E1;
[0013] 取浸膏E1再次进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇等度洗脱，收集6-8柱体积洗 脱部位，浓缩得浸膏E2;
[0014] 取浸膏E2进行反相硅胶柱层析，用水-甲醇等度洗脱，收集4-5柱体积洗脱部位， 浓缩得浸膏E3;
[0015] 取浸膏E3用制备型高效液相色谱分离，用水-甲醇梯度洗脱，从水-甲醇洗脱部 位得到所述二萜类化合物。
[0016] 所述将滤渣用乙醇溶液提取三次，优选为95%乙醇溶液；
[0017] 所述用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱，优选为体积比30 : 1乙酸乙酯-乙醇；
[0018] 所述二氯甲烷-甲醇等度洗脱，优选为体积比15 : 1二氯甲烷-甲醇；
[0019] 所述取浸膏E2进行反相硅胶柱层析，用水-甲醇等度洗脱，优选为体积比55 : 45 水-甲醇；
[0020] 所述取浸膏E3用制备型高效液相色谱分离，用水-甲醇梯度洗脱，优选为体积比 60 : 40水-甲醇。
[0021] 为解决上述技术问题，本发明又提供了一种从闹羊花中提取二萜类化合物的方 法，所述方法包括：
[0022] 取闹羊花，用二氯甲烷提取三次脱脂，过滤，收集滤渣；
[0023] 将滤渣用乙醇溶液提取三次，过滤，收集滤液，减压浓缩得乙醇提取物；
[0024] 将乙醇提取物加水制成提取物水悬液，以石油醚萃取三次再次脱脂后，以乙酸乙 酯萃取三次，获得的乙酸乙酯萃取液浓缩，再以饱和碳酸氢钠水溶液萃取三次，取乙酸乙酯 相蒸干，获得乙酸乙酯萃取物粗品；
[0025] 将粗品在硅胶上进行柱层析，用乙酸乙酯_乙醇梯度洗脱，获得乙酸乙酯-乙醇洗 脱物，浓缩得浸膏E1;
[0026] 取浸膏E1再次进行硅胶柱层析，用二氯甲烷_甲醇等度洗脱，收集6-8柱体积洗 脱部位，浓缩得浸膏E2;
[0027] 取浸膏E2进行反相硅胶柱层析，用水-甲醇等度洗脱，收集4-5柱体积洗脱部位， 浓缩得浸膏E3;
[0028] 取浸膏E3用制备型高效液相色谱分离，用水-甲醇梯度洗脱，从水-甲醇洗脱部 位得到所述二萜类化合物。
[0029] 为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如前述任一项所述二萜类化合物在制 备抗肿瘤药物中的应用。
[0030] 所述的肿瘤可以为结肠癌细胞株HT-29、结肠癌细胞株HCT-8、肝癌细胞株 Bcl-7402、非小细胞肺癌细胞株A549和/或乳腺癌细胞株MCF-7。
[0031] 为解决上述技术问题，本发明另提供了一种如前述任一项所述二萜类化合物在检 测抗肿瘤药物的活性中的应用。
[0032] 所述的肿瘤可以为结肠癌细胞株HT-29、结肠癌细胞株HCT-8、肝癌细胞株 Bcl-7402、非小细胞肺癌细胞株A549和/或乳腺癌细胞株MCF-7。
[0033] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前述任一项所述二萜类化合物在筛 选抗肿瘤药物中的应用。
[0034] 所述的肿瘤可以为结肠癌细胞株HT-29、结肠癌细胞株HCT-8、肝癌细胞株 Bcl-7402、非小细胞肺癌细胞株A549和/或乳腺癌细胞株MCF-7。
[0035] 本发明有益的技术效果在于，本发明二萜类化合物对结肠癌细胞（HT-29、HCT_8)、 肝癌细胞（Bcl-7402)、非小细胞肺癌（A549)和/或乳腺癌（MCF-7)具有很强的抑制作用， 其中对结肠癌细胞（HT-29、HCT-8)、肝癌细胞（Bcl-7402)和乳腺癌（MCF-7)的抑制作用强 于阳性药对照；另一方面，化合物I对正常细胞（人脐静脉内皮细胞VEC)的抑制作用要弱 于阳性药，表明本发明化合物I具有抗