复性浓缩后得到的包涵体蛋白EtpA融合蛋 白，其序列为SEQ ID N0. 2所示，以Bradford法测定蛋白质浓度。
[0018] -种人源肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白的复性方法，其步骤如下：
[0019] 接种菌株至300mL培养基中，诱导表达，从培养液中收集菌体，再重悬于预冷的 30ml的BufferA中，压力破碎仪破碎3-5次，离心保留沉淀，30ml BufferA重悬沉淀，缓慢加 入10%SKL，不停搅拌至沉淀溶解，溶液澄清，4°C静置2h。继续加入终浓度0. 2%的PEG4000、 600 ii L50m M氧化型谷胱甘肽与100mM还原型谷胱甘肽，4°C静置2h，lOOOOrpm离心15min 弃去未溶解的菌体杂质，即得。
[0020] BufferA :Tris6. 055g，EDTA0. 186g，NaC12. 925g，甘油 50mL，加入 ddH20 定容至 1L， 使用前现加入DTT至终浓度0. 5mmol/L。
[0021] 一种利用EtpA融合蛋白制备的卵黄抗体，其制备步骤如下：
[0022] 向复性、浓缩后的EtpA融合蛋白溶液中加入灭菌的tween-80至终浓度4%，再与等 体积白油佐剂在组织匀楽机中混合30min，充分乳化至蛋白浓度为0. 5mg/mL。将蛋鸡随机 分2组，空白组50只（生理盐水）和免疫组100只。采用胸部肌肉注射(每侧500UL)。首 免2周后各组分别用相同油乳苗加强免疫一次，间隔2周再次免疫，二免后每周各组随机采 集5枚鸡蛋，提纯收集卵黄抗体，间接ELISA监测抗体效价变化，western-blot鉴定卵黄抗 体的特异性，待卵黄抗体效价达1:2 9后收集鸡蛋。将收集的鸡蛋去壳，搅拌，喷雾干燥(进 气150°C，出气70°C)，冷却后装入密封的样品袋内。
[0023] -种卵黄抗体在制备抗人源产肠毒素大肠杆菌免疫疫苗中的应用，其应用过程如 下：
[0024] 建立ETEC在小鼠肠道中的定植模型，以临床常见的ETEC菌株（H10407)攻毒小鼠， 同时将前期制备的卵黄抗体口服后，不同的抗体组对细菌产生了不同程度抑粘附效果。其 中标准菌株H10407的抗体组降低了感染小鼠的数量。通过细胞粘附试验，证实了卵黄抗体 在体外同样发挥了类似的抗粘附作用。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0026] 本实验中表达的目的蛋白主要在包涵体中存在，为了使后期制备抗体效价更高， 抗体效果更好，我们通过采用SKL，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽对表达的目的蛋白进 行复性。在后期免疫过程中获得了较高效价的卵黄抗体。
【附图说明】
[0027] 图1为一种etpA基因的重组质粒构建路线不意图。
[0028] 图中pMD18-T是克隆载体，pGEX-KG是表达载体。pGEX-etpA是插入了 etpA基因 的重组质粒，BamHI、Xh〇I为质粒上的限制性内切酶位点。
[0029] 图2为PCR扩增etpA产物的琼脂糖凝胶电泳示意图。
[0030] 图中产物etpA分子量大小为1700bp ;M为DNA分子量标准DL2000。
[0031] 图3为重组表达质粒pGEX-etpA的双酶切鉴定电泳示意图。
[0032] 图中M为DNA分子量标准DL2000;泳道EtpA :pGEX-etpA，插入片段2260bp。
[0033] 图4为基因工程菌IPTG诱导蛋白表达前后的SDS-PAGE电泳检测示意图。
[0034] 图中1、2分别代表重组蛋白EtpA诱导前后，所得蛋白分子量为84kDa。
[0035] 图5为基因工程菌经诱导后重组蛋白的可溶性分析示意图。
[0036] 图中1、2 :pGEX-etpA BL21 (DE3)诱导后的上清和沉淀；M为蛋白质分子量标准。
[0037] 图6为不同温度条件对EtpA融合蛋白表达量的影响示意图。
[0038] 1、2 :37°C诱导后的上清和沉淀；3、4 :25°C诱导后的上清和沉淀；5、6 :17°C诱导后 的上清和沉淀；箭头：目的蛋白。
[0039] 图7为诱导剂浓度对EtpA融合蛋白表达量的影响示意图。
[0040] 1:诱导前；2、3、4、5、6 :IPTG 浓度分别为 0? 1、0. 3、0. 5、1. 0、1. 2mmol/L;箭头：目 的蛋白。
[0041] 图8为浓缩复性后的蛋白质SDS-PAGE电泳分析示意图。
[0042] 图9为Western-Blot检测重组蛋白EtpA的抗原性示意图。
[0043] 图10为第二次免疫后卵黄抗体效价随时间的变化规律示意图。
[0044] 图11为卵黄抗体对人源ETEC H10407小鼠肠道的抗粘附效果示意图。
[0045] 水平线表示几何平均数，*表示差异显著，**表示差异极显著。
[0046] 图12为卵黄抗体对人源ETEC H10407上皮细胞的抗粘附效果示意图。
[0047] 水平线表示几何平均数，*表示差异显著，**表示差异极显著。
【具体实施方式】
[0048] 下列具体实施例中未经特别说明的方法均参照美J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔 (J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)，北京：科学出 版社，2002年)。本发明所用试剂，细胞或菌株，若无特别说明，均来源于商业渠道。
[0049] 实施例1:肠毒素大肠杆菌EtpA重组质粒的构建
[0050] 1、本实施例使用的菌株和质粒载体见下表1。
[0051] 表1菌株和质粒
[0052]
【主权项】
1. 一种含有人源产肠毒素大肠杆菌粘附素基因的重组质粒pGEX-ei^，其核苷酸序列 为SEQIDNO. 1 所示。
2. 含有权利要求1所述重组质粒的基因工程菌。
3. 权利要求2所述基因工程菌表达的融合蛋白，其序列为SEQIDNO. 2所示。
4. 利用权利要求3所述的融合蛋白制备的卵黄抗体。
5. 权利要求4所述的卵黄抗体在体外抑制产肠毒素大肠杆菌粘附中的应用。
6. 权利要求4所述的卵黄抗体在制备抗人源产肠毒素大肠杆菌免疫疫苗中的应用。
7. 权利要求3所述的融合蛋白在制备抗腹泻蛋类中的应用。
8. -种人源肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白的复性方法，其步骤如下： 接种菌株至300mL培养基中，诱导表达，从培养液中收集菌体，再重悬于预冷的30ml的BufferA中，压力破碎仪破碎3-5次，离心保留沉淀，30mlBufferA重悬沉淀，缓慢加入 10%SKL，不停搅拌至沉淀溶解，溶液澄清，4°C静置2h; 继续加入终浓度0. 2%的PEG4000、600iiL50mM氧化型谷胱甘肽与IOOmM还原型谷 胱甘肽，4°C静置2h，1000 Orpm离心15min弃去未溶解的菌体杂质，即得； BufTerA :Tris 6. 055g，EDTA 0? 186g，NaCl 2. 925g，甘油 50mL，加入 CldH2O 定容至 1L， 使用前现加入DTT至终浓度0. 5mmol/L; 所述的菌株为含有重组质粒pGEX-ei^的工程菌，重组质粒的序列为SEQIDNO. 1所 /Jn〇
【专利摘要】本发明公开了一种人源肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用，本发明提供了一种含有人源肠毒素大肠杆菌的粘附素基因的重组质粒pGEX-etpA，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导重组表达菌BL21(DE3)/pGEX-etpA表达融合蛋白EtpA。利用表达的重组蛋白主动免疫初产蛋鸡，制备了针对这种蛋白的卵黄抗体，提取的卵黄抗体验证了重组蛋白具有良好的抗原性，并利用小鼠肠道攻毒试验及体外实验，证明提纯的卵黄抗体能够抑制ETEC菌株在小鼠肠道内及体外对上皮细胞的粘附。
【IPC分类】C12P21-02, C12N15-70, C07K16-02, C07K19-00, A61K39-40, C07K16-12, C07K1-113, A61P31-04, A61P1-12, C12N1-21
【公开号】CN104789584
【申请号】CN201410024763
【发明人】彭健, 王荣, 蒋思文, 潘中勉
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年1月20日