°C，提取120min后，将提取液转移至冷冻离心机中，调整转速至7500rpm，温 度为5°C，离心20min后，收集上清液，得到4. 75L清液；调整温度至95°C，加入耐热α -淀 粉酶4. 75 μ L，保持搅拌恒温酶解120min，调整pH至4. 3静置30min后转移至离心机中， 调整转速至调整转速至7500rpm，温度为5°C，离心20min后，收集得到沉淀约397克；加入 I. 2L去离子水，调整pH至7. 0充分搅拌30min后，调整温度至60°C，加入0. 25%。的胰酶 +0. 25%。Alcalase酶，酶解5h后，将温度升高至105°C灭酶后，转移至旋转蒸发仪浓缩至固 形物含量至30%，喷干得到118克肽粉，喷雾干燥进料口温度为170°C，出料口温度为70°C; 干燥后所得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量为55% (根据GB/T22492-2008中肽含量测 试方法进行测试）。
[0049] 实施例2
[0050] 取1000克（粗蛋白含量28% )燕麦粉，按照1 :15加入去离子水，调整pH至9. 5,温 度45°C，提取130min后，将提取液转移至冷冻离心机中，调整转速至3500rpm，温度为4°C， 离心30min后，收集上清液，得到13. 5L清液；调整温度至75°C，加入中温淀粉酶6. 75 μ L， 保持搅拌恒温酶解180min，调整pH至2. 5静至30min后转移至离心机中，调整转速至调整 转速至3500rpm，温度为4°C，离心30min后，收集得到沉淀约810克；加入2. 5L去离子水， 调整pH至5. 5充分搅拌30min后，调整温度至45°C，加入0. 5%。的枯草杆菌蛋白酶+0. 5%〇 胃蛋白酶，酶解15h后，将温度升高至105°C灭酶后，转移至旋转蒸发仪浓缩至固形物含量 至40 %，喷干得到240克肽，喷雾干燥进料口温度为180°C，出料口温度为80°C ;干燥后所 得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量为62. 5% (根据GB/T22492-2008中肽含量测试方法 进行测试）。
[0051] 实施例3
[0052] 取500克（粗蛋白含量28% )燕麦粉，按照1 :5加入去离子水，调整pH至8. 5， 温度30°C，提取150min后，将提取液转移至冷冻离心机中，调整转速至lOOOOrpm，温度为 I. 5°C，离心10min后，收集上清液，得到2. 45L清液；调整温度至65°C，加入中温淀粉酶+ 糖化酶（I: 1)共12. 25 μ L，保持搅拌恒温水解5h，调整pH至5后静至30min后转移至离心 机中，调整转速至调整转速至lOOOOrpm，温度为I. 5°C，离心10min后，收集得到沉淀约370 克；加入I. IL去离子水，调整pH至5. 5后充分搅拌30min后，调整温度至55°C，加入0. 75%〇 的枯草杆菌蛋白酶+0. 75%。胰蛋白酶，酶解IOh后，将温度升高至105°C灭酶后，转移至旋转 蒸发仪浓缩至固形物含量至25%，喷干得到103克肽粉，喷雾干燥进料口温度为200°C，出 料口温度为l〇〇°C ;干燥后所得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量为71. 5%。（根据GB/T 22492-2008中肽含量测试方法进行测试）
[0053] 第二部分燕麦蛋白肽指标的测试及动物实验测试
[0054] 2. 1燕麦蛋白肽参数的测定：
[0055] 将实施例1中制备的燕麦蛋白肽进行检测，检测结果见图1和表1。
[0056] 表1实施例1-3中燕麦蛋白肽的分析检测结果
[0057]
[0058] 从表1中看出燕麦蛋白肽大部分为小分子肽。其中，分子量为3000Da以下的小分 子组分占70%以上。另外抗氧化活性ORAC活性较高，是一种优良的抗氧化制剂。
[0059] 2. 2燕麦蛋白肽对炎症抑制的动物试验部分
[0060] 2. 2. 1试验动物：选取C57BL/6小鼠，雄性，5周龄，10只，
[0061] 2. 2. 2试验试剂型号：IL-2(m)ELISA kit产品型号：EK0398博士德
[0062] IL-6(m)ELISA kit 产品型号：EK0411 博士德
[0063] TNF-a (m) ELISA kit 产品型号：EK0527 博士德
[0064] 2. 2. 3试验方案：10只小鼠平均分为两组：分别设定为实验组和空白对照组。
[0065] 实验组：每隔一天用配制好的燕麦肽溶液（实施例1制备）灌胃，每周天测量体 重。
[0066] 空白组：每隔一天灌胃生理盐水，每周测量体重。
[0067] 2. 2. 4测试方法：喂养30天后，处死小鼠，心脏取血测量血清炎症因子（IL-2、 IL-6、TNF-a)，采用ELISA酶联免疫法进行测试。
[0068] 2. 2. 5结果评价：见下表2中所示。
[0069] 表2小鼠实验炎症因子指标结果
[0070]
[0071] 从上表2结果可见经小鼠实验可知，经过该发明所制备的燕麦蛋白肽对肠道炎症 因子IL-6、TNF-a具有显著的抑制效果。因此，本发明制备的燕麦蛋白肽可以作为食品添加 剂用于抑制肠道炎症反应方面的疾病，即燕麦蛋白肽可以在制备具有抑制肠道炎症反应的 食品添加剂中应用。
[0072] 显然，上述内容只是为了说明本发明的特点，而并非对本发明的限制，有关技术领 域的普通技术人员根据本发明在相应的技术领域做出的变化应属于本发明的保护范畴。
【主权项】
1. 一种具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征是含有以下步骤： (1) 蛋白质提取：取燕麦粉，加水配成乳液，调整好乳液的PH值和温度进行提取后离 心，所得上清液即为燕麦粗蛋白溶液； (2) 蛋白质纯化：在燕麦粗蛋白溶液中加入糖酶进行酶解，酶解完成后调整pH值并静 置，离心沉降，所得沉淀即为燕麦蛋白； (3) 复溶：在燕麦蛋白中加入水，并调节pH值，得燕麦蛋白溶液； (4) 酶解：在燕麦蛋白溶液中加入细菌源蛋白酶和动物源蛋白酶的复合酶进行酶解， 得到酶解液； (5) 干燥：将酶解液灭酶、浓缩和干燥后，所得产物即为燕麦蛋白肽。2. 根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征 是：步骤（1)中水的用量为燕麦粉总质量的1~15倍；乳液的pH值为8~11，温度为30~ 60°C，提取时间为120~150min;离心时离心机转速为3000~lOOOOrpm，离心机温度为 1. 5~5°C，离心时间为10~30min。3. 根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征 是：步骤（2)中所述的糖酶为中温淀粉酶、耐热淀粉酶和糖化酶中的一种或几种，糖酶与燕 麦粗蛋白溶液的用量关系为〇. 5~5yL/L，酶解温度为55~95°C，酶解时间为0. 5~5h。4. 根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征 是：步骤（2)中pH值为2~5,离心时离心机转速为3000~lOOOOrpm，离心机温度为1. 5~ 5°C，离心时间为10~30min。5. 根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征 是：步骤（3)中水的用量为燕麦蛋白总质量的1~5倍，pH值为5. 5~7. 5。6. 根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征 是：步骤（4)中所述的细菌源蛋白酶为alcalase或枯草杆菌蛋白酶；所述的动物源蛋白酶 为胰蛋白酶、胃蛋白酶或胰酶，所述细菌源蛋白酶和动物源蛋白酶的复合酶的用量占燕麦 眼白溶液总质量的0. 5~1. 5%。，酶解温度为40~65°C，pH值为3. 5~8,酶解时间为3~ 15h〇7. 根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征 是：步骤（5)中浓缩采用真空浓缩，真空浓缩至固形物含量为20~60%，干燥采用喷雾干 燥，喷雾干燥进料口温度为170~200°C，出料口温度为70~KKTC。8. 根据权利要求1所述的具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，其特征 是：步骤（5)中所得产物中燕麦蛋白肽的质量百分含量在50%以上。9. 采用权利要求1-8任一项具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法制成的 燕麦蛋白肽。10. 权利要求9中的燕麦蛋白肽在制备具有抑制肠道炎症反应功效的食品添加剂中应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有抑制肠道炎症活性的燕麦蛋白肽的制备方法，含以下步骤：在燕麦粉中加水配制乳液，将乳液调节酸碱度后分离出上层蛋白粗液；经过糖酶酶解除去淀粉杂质后、调节酸碱度，离心分离得到蛋白质沉淀；将蛋白质沉淀复溶配制成蛋白质溶液后，再经过复配蛋白酶酶解后得到酶解液，酶解液经浓缩、干燥即得到目标产品燕麦蛋白肽粉。所提取的燕麦蛋白肽具抑制肠道炎症活性的功效，可作为功能性食品配料添加于各类食品中。
【IPC分类】A61K38/02, A61P1/00, C12P21/06, C07K2/00, A61P29/00
【公开号】CN104928339
【申请号】CN201510282944
【发明人】彭俊生, 吴晓滨, 赵谋明, 陈泓磊, 苏国万, 吴惜玲
【申请人】中山大学附属第六医院, 广州市加和检测技术服务有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月27日