[0022]RNA温度计序列如下
[0023]RNAT3:5’ >UACUAGAGCUCUUUAAAAAAAAAAAGUACUAAGGAGUACUAG〈3，
[0024]RNAT5:5’ >UACUAGAGCUCCUUAAAAAAAAAAAGUACUAAGGAGUACUAG〈3，
[0025]RNAT8:5， >UACUAGAGCUCCUUGGAUCCAGUACUAAGGAGUACUAG〈3，
[0026]RNAT9:5， >UACUAGAGCUCUUUGGAUCCAGUACUAAGGAGUACUAG〈3，
[0027]RNATlO:5’ >UACUAGAGGAGCUCCUUGGAUCCAGUACUAAGGAGACCUA
[0028]CUAG〈3’
[0029]RNATll:5，>UACUAGAGCUCCUUCAGAAGGAGUACUAG〈3，
[0030]RNATI2:5， >UACUAGA⑶CUCCUUAGAAGGAGUACUAG〈3，
[0031]实施例2:梯级耐热系统的组装
[0032](I)以单个功能耐热元件和特定温度敏感RNA温敏开关组装成单功能温敏耐热系统:启动子-RNA温敏开关-耐热功能元件，适用于提高大肠杆菌在特定高温下的耐热性，并且减少在常温下的过表达热激蛋白带来的代谢负荷；(2)不同温度响应的RNA温敏开关与相应温度功能最优的耐热功能元件的理性组装:启动子-RNA温敏开关(T1°C )_耐热功能元件(T1°C )-启动子-RNA温敏开关(T2°C )-耐热功能元件(T3°C )-……-启动子-RNA温敏开关(Tn°C )-耐热功能元件(Tn°C ) (T1°C <T2°C <……<Tn°C )，适用于在不同温度表达不同的耐热功能元件，来拓宽微生物的最适生长温度。例如J23119 (promoter)-RNAT3-GroES-J23119-RNAT12-ThiF可以将大肠杆菌的最适生长温度拓宽到40°C。
[0033]实施例3:群体数量系统的构建与组装
[0034]本方法通过集成群体感应系统和RNA温敏开关构建了温敏型群体数量调控系统。RNA温度计(RNAT12)与感应AHL浓度的启动子pluxR构成了一个响应密度和温度的与门开关。微生物在发酵过程中可以自由生长，不再受数量调控的浓度限制，但是当密度足够高时，微生物释放的热量也相应增加，当代谢热导致体系温度达到一定值时，RNA温度计便会开启，启动下游毒素蛋白的表达，致使细胞死亡，但是细胞浓度也不是无限制的下降，最终细胞浓度会被控制在由群体感应系统设定的细胞浓度。换言之，只有当细胞浓度导致热胁迫时群体数量调控系统才会诱导PCD过程。
[0035]实施例4:耐热系统与群体数量调控系统的协同耐热
[0036]用单一的简单的方法来提高复杂生物系统的耐热性是不现实的，耐热微生物通常通过多个不同的基因甚至不同的系统之间的多水平协同作用来抵抗热胁迫的影响。因此，将梯级耐热系统与群体数量调控系统集成，可以在细胞水平和微生物群体水平上提高生物转化的耐热性与转化效率。细胞水平上，主要由耐热系统发挥作用，提高大肠杆菌本身的抗热能力。但是耐热系统的功能不是无限的。伴随着发酵体系中大量的发酵热的生成，在没有冷却系统时，发酵温度会升高到超出耐热系统能力的范围，或者在发酵体系忽然遭受超出耐热系统的极端环境。群体感应系统就会发挥作用，通过开启利他程序性死亡，来提高微生物群体在高温下的生存能力。耐热系统与群体数量调控系统，在不同的阶段，不同的水平发挥作用，就像两个齿轮之间的相互作用环环相扣，通过动态调控，梯级组织，功能的上备份，从多水平上提高了微生物的耐热性。
[0037]实施例5:微生物智能耐热梯级调控方法的应用
[0038]对于不同性能不同特定微生物以及不同的发酵条件，对其量身定制的构建耐热系统与数量调控系统。将不同的RNA温敏开关与热激蛋白适配性的组装。同时与门开关可以通过调节RNA温敏开关感受温度，使其在需要的温度下打开，同时还可以更换群体感应系统中的启动子，调节群体数量调控系统控制的密度阈值。
【主权项】
1.一种微生物的智能梯级耐热调控方法。其特征在于包括两个系统，梯级耐热系统和数量调控系统。能在细胞和菌群两个层面上提高微生物的耐热性。并且应用于工业微生物耐热性的改造，不仅可以强化在高温下的生产效率，而且还可以降低冷却成本。2.如权利I要求所述的微生物梯级耐热系统包括从嗜热微生物中筛选得到的热激蛋白(HSPs)、类泛素、泛素和转录因子等作为耐热功能元件，以人工设计的RNA温敏开关与启动子组合为调控元件。利用RNA温敏开关对不同温度响应开启最佳耐热功能元件的表达，实现微生物的梯级耐热，可成功地拓宽微生物的最适生长温度。3.如权利I要求所述的微生物数量调控系统则利用群体感应系统和RNA温敏开关组合为与门开关，动态地开启利他性程序死亡系统，有效地控制了系统的代谢热，从而在菌群层面上提高微生物适应热胁迫的能力。4.如权利2，3所述的微生物梯级耐热系统与微生物群体数量调控系统，通过集成两个系统提高了微生物对特定高温以及高温波动的适应性与鲁棒性。5.如权利4所述的智能梯级耐热系统可应用于工业、食品、能源、环境和医药等领域的微生物耐热性改造。
【专利摘要】发酵过程中，微生物的生长和生产经常遭受热胁迫的限制。以构建耐热大肠杆菌底盘宿主为目的，本发明利用合成生物学方法创建了一种微生物智能梯级耐热调控方法，能在细胞和菌群两个层面上提高微生物的耐热性，其主要包括梯级耐热系统和数量调控系统。梯级耐热系统包括热激蛋白(HSPs)、泛素和转录因子等耐热功能元件，以人工设计的RNA温敏开关与启动子组合为调控元件，可以实现微生物的梯级耐热。微生物数量调控系统则利用群体感应系统和RNA温敏开关组合为与门开关，动态地开启利他性程序死亡系统，有效地控制代谢热，在菌群层面上提高微生物适应热胁迫的能力。通过两个系统的协同作用，提高了微生物对特定高温以及高温波动的适应性与鲁棒性。
【IPC分类】C12R1/19, C12N15/09, C12N15/113, C12N15/31
【公开号】CN105002188
【申请号】CN201510069358
【发明人】李春, 贾海洋, 孙欢, 孙翔英, 冯旭东
【申请人】北京理工大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年2月10日