具有高阻断活性的抗-C5a结合部分的制作方法

具有高阻断活性的抗-C5a结合部分的制作方法
【专利说明】具有高阻断活性的抗-C5a结合部分 本申请为分案申请，原申请的申请日为2010年11月26日，申请号为 201080062363. 8 (PCT/EP2010/007197)，发明名称为"具有高阻断活性的抗-C5a结合部 分"。
[0001] 本发明涉及与C5a (尤其是人C5a)的构象表位特异性结合的结合部分。优选的结 合部分是与该构象表位结合的抗_C5a抗体。本文所述的结合部分作为活性物质在用于治 疗和预防各种急性和慢性疾病的药物组合物中有用，疾病尤其是急性炎性疾病（例如全身 炎症反应综合征（SIRS))和不同程度的脓毒症（包括脓毒症、重度脓毒症和脓毒性休克）。
[0002] 发明背景 C5a在补体激活时裂解自C5。在补体激活产物中，C5a是最强效力的炎性肽之一，具有 广谱的功能（Guo和Ward 2005)。C5a是存在于健康人血液中的具有11. 2kDa分子量的糖 蛋白。C5a的多肽部分包含74个氨基酸，占8. 2kDa的分子量，同时糖部分占大约3kDa。C5a 通过高亲和力C5a受体（C5aR和C5L2)发挥其效应（Ward 2009)。C5aR属于具有七个跨膜 区段的G蛋白偶联受体的视紫红质型家族；C5L2类似但不是G蛋白偶联的。目前认为C5a 主要通过C5a-C5aR相互作用发挥其生物学功能，因为对于C5a-C5L2相互作用几乎没有发 现生物应答。C5aR在许多器官（尤其是肺和肝）的髓样细胞（包括嗜中性粒细胞、嗜酸性 粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞）和非髓样细胞上广泛表达，表明C5a/C5aR信号转导的 重要性。C5a具有多种生物学功能（Guo和Ward 2005)。C5a对嗜中性粒细胞是强化学引 诱物，并对单核细胞和巨噬细胞也具有趋化活性。C5a在嗜中性粒细胞中引起氧化爆发（0 2 消耗）并增强吞噬作用和颗粒酶的释放。亦发现C5a为血管舒张剂。已显示C5a参与调 节来自各种细胞类型的细胞因子表达，来增加嗜中性粒细胞上黏着分子的表达。据发现当 C5a在疾病环境中过度产生时，它变得高度有害，因为它对在炎性反应链的上游起作用的炎 症反应是强诱导物和增强物。高剂量的C5a对嗜中性粒细胞可导致非特异性趋化"脱敏"， 藉此引起广泛的功能异常（Huber-Lang等2001a)。
[0003] 已报道C5a发挥众多促炎症反应，并且已报道其在脓毒症期间是有害的。通过抗 体抑制C5a或C5a受体（C5aR)在小鼠和大鼠的各种脓毒症模型中已显示显著改善存活 (Czermak 等 1999 ;Guo 等 2000 ;Huber_Lang 等 2001b ;Riedemann 等 2002a)。此外，各种 报道已显示C5a在实验性脓毒症期间对完整的先天性免疫和器官功能的有害作用（Guo等 2000 ;Guo 等 2002 ;Huber_Lang 等 2001a ;Huber_Lang 等 2002 ;Laudes 等 2002 ;Riedemann 等2003;把6(161]1&1111等2004&;1^6(161]1&1111等200413)。05&作为过敏毒素起作用，并且已报道 其发挥众多促炎性作用。在人中，脓毒症高水平的C5a在各种研究中已报道与显著恶化的 结果相关（Bengtson 和 Heideman 1988 ;Nakae 等 1994 ;Nakae 等 1996) 〇
[0004] 在脓毒症的实验环境中，将嗜中性粒细胞暴露于C5a可导致嗜中性粒细胞功能异 常和信号转导途径的瘫痪，导致NADPH氧化酶的缺陷装配、MAPK信号转导级联的瘫痪、非常 受阻抑的氧化爆发、吞噬作用和趋化性（Guo等2006a ;Huber-Lang等2002)。胸腺细胞凋 亡和延迟的嗜中性粒细胞凋亡对于依赖于C5a存在的脓毒症发生是两种重要的致病事件 (Guo等2000 ;Guo等2006b)。在实验性脓毒症期间，C5a上调嗜中性粒细胞上的0 2整联 蛋白表达来促进细胞迀移至器官中（Guo等2002)，其为多器官衰竭（MOF)的一个主要原因。 亦发现C5a可归因于实验性脓毒症中发生的凝固途径的激活（Laudes等2002)。C5a刺激 来自人白细胞的促炎细胞因子（例如TNF-a、IL-P、IL-6、IL-8和巨噬细胞移动抑制因子 (MIF))的合成和释放（Hopken 等 1996 ;Riedemann 等 2004a ;Strieter 等 1992)。C5a 与 LPS在肺泡上皮细胞中产生TNF-a、巨噬细胞炎性蛋白（MIP)_2、细胞因子诱导的嗜中性粒 细胞化学引诱物（CINC)-l和IL-1 0时起强协同作用（Riedemann等2002b ;Rittirsch等 2008) 。鉴于补体激活是脓毒症发病期间发生的事件，C5a可能在"炎性细胞因子风暴"出 现前开始起作用。C5a似乎在指挥协调细胞因子网络的实现和全身炎症反应综合征（SIRS) 的形成中起关键作用。在实验性脓毒症环境中阻断C5a显著减轻MOF和SIRS。在脓毒症 发病期间发生C5aR表达的普遍上调，且通过抗_C5a、或抗_C5aR抗体、或C5aR拮抗剂阻 断C5a/C5aR相互作用在啮齿类动物脓毒症模型中提供高度保护效应（Czermak等1999 ; Huber-Lang 等 2001b ;Riedemann 等 2002a)。
[0005] 除了脓毒症适应症外，阻断C5a亦被证明在许多其他炎症模型中为保护性的，炎 症例如各种物种中的缺血/再灌注损伤、肾脏疾病、移植排斥、疟疾、类风湿性关节炎、感 染性肠病、炎性肺病、狼疮样自身免疫疾病、神经退行性疾病等，如由Klos A.等（Klos等 2009) 和Allegretti M?等（Allegretti等2005)部分综述。此外，最近发现阻断C5a在小 鼠的肿瘤模型中显示强治疗益处（Markiewski等2008)。
[0006] 本发明基础的技术问题 现有技术中已知与C5的C5a部分而不是C5b部分特异性结合的抗体（Klos等（1998) J. Immunol. Meth. 111:241-252 ;TO 01/15731;TO 03/015819)。
[0007] 然而，先前产生的抗_C5a抗体对C5a诱导的生物效应仅显示中等的阻断活性。因 此，现有技术的抗_C5a抗体要么不能实现C5a诱导的生物效应的彻底阻断，要么必须以超 化学计量的量使用来达到C5a活性的相当高的阻断。
[0008] 因此，尤其考虑到在患者中的潜在临床使用，在现有技术中仍需要对C5a诱导的 生物效应显示更强阻断活性，同时与C5a以高亲和力特异性结合的抗_C5a抗体或其他结合 部分。同样地，优选这样的抗体不应该与C5b结合，并因此不应该影响C5b的生物活性。
[0009] 非常出人意料地，本发明的发明人能够鉴定一种新构象结合表位和满足上述更高 要求等的相应的结合抗体。在本发明基础的繁琐实验中，可产生超过2000种抗-C5a抗体， 当以化学计量的量使用时（即每摩尔的C5a为0. 5摩尔的二价抗体），两种抗_C5a抗体对 C5a诱导的生物效应显示空前的阻断活性。
[0010] 上面概述未必描述由本发明解决的所有问题。
[0011] 发明概述 在第一方面，本发明涉及一种结合部分，其与由C5a的氨基酸序列XAETCE&RXJSEQ ID N0:18)和 X5X6KX7XsX9L(SEQ ID N0:19)形成的构象表位结合，其中 Xi选自 N、H、D、F、K、 Y和T;X2选自D、L、Y和H;X3选自Q、E和K;X 4选自A、V和L;X5选自S、H、P和N;X6选自 H和N ;X7选自D、N、H、P和G ;X s选自M、L、I和V ;和X 9选自Q、L和I。
[0012] 在第二方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含：（i)如在SEQ ID N0:6中所示的重链CDR3序列；或（ii)如在SEQ ID N0:7中所示的重链CDR3序列；其中重 链⑶R3序列任选包含1、2或3个氨基酸置换，1、2或3个氨基酸缺失和/或1、2或3个氨 基酸添加。
[0013] 在第三方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含：(a)根据第一方面的结合部分 或（b)根据第二方面的抗体或其抗原结合片段，并另外包含一种或多种药学上可接受的载 体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。
[0014] 在第四方面，本发明涉及（a)根据第一方面的结合部分或（b)根据第二方面的抗 体或其抗原结合片段用于制备用于预防和或治疗以下各种疾病的药物组合物的用途：涉及 急性炎症的疾病，例如全身炎症反应综合征（SIRS)、脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克、缺血 /再灌注相关的损伤（例如缺血性心脏病）、急性肺损伤、肺炎、移植患者中的急性和慢性移 植排斥、移植物抗宿主反应，以及涉及慢性类型的炎症的疾病，例如肾小球疾病（例如肾小 球性肾炎）和其他实体的肾衰竭、类风湿性关节炎和类似的自身免疫疾病（例如别赫捷列 夫氏疾病（Bechterew' s disease))、狼疮型疾病、炎性肠病、克罗恩病、肿瘤生长或实体器 官癌症。
[0015] 在第五方面，本发明涉及一种在有需要的患者中治疗以下疾病的方法：全身炎症 反应综合征（SIRS)、脓毒症、重度脓毒症、脓毒性休克、缺血/再灌注相关的损伤（例如缺血 性心脏病）、急性肺损伤、肺炎、移植患者中的急性和慢性移植排斥、移植物抗宿主反应、肾 小球疾病（例如肾小球性肾炎）和其他实体的肾衰竭、类风湿性关节炎和类似的自身免疫 疾病（例如别赫捷列夫氏疾病）、狼疮型疾病、炎性肠病、克罗恩病、肿瘤生长或实体器官癌 症，该方法包括向患者给予有效量的（a)根据第一方面的结合部分或（b)根据第二方面的 抗体或其抗原结合片段。
[0016] 本发明的本概述未必描述本发明的所有特征。
[0017] 发明详述 在下文详述本发明之前，应该理解本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂， 因为这些可变化。还应该理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不 旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由附加的权利要求所限制。除非另外规定，本文 使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0018] 优选地，本文使用的术语定义为如〃A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Reco_endations)(生物技术术语的多语言词汇表： (IUPAC 推荐））"，Leuenberger, H.G.W, Nagel, B?和丨(6丨bl, H?主编（1995)，Helvetica Chimica Acta, CH_4010Basel, Switzerland)中所述。
[0019] 贯穿本说明书及下面的权利要求，除非上下文中另有规定，措词"包含"以及变化 例如"包括"和"含有"，将被理解为意指包含规定的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不 排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。
[0020] 贯穿本说明书的正文引用一些文献。本文引用的各文献（包括所有专利、专利申 请、科技出版物、制造商的说明书、使用说明、GenBank登录号序列提交物等），不管在上文 还是在下文，通过引用以其整体结合到本文中。本文任何内容均不应视为承认本发明无权 早于凭借在先发明的这种公开。
[0021] 本文使用的"人C5a"指下述74个氨基酸肽： TLQKKIEEIA AKYKHSVVKK CCYDGACVNN DETCEQRAAR ISLGPRCIKA FTECCVVASQ LRANISHKDM QLGR(SEQ ID NO:1)〇
[0022] 本文使用的术语"结合部分"指可与靶分子或靶表位特异性结合的任何分子或分 子部分。在本申请的上下文中优选的结合部分是（a)抗体或其抗原结合片段；(b)寡核苷 酸；（c)抗体样蛋白；或（d)肽模拟物。可用于实践本发明的"结合部分"能够与由两条氨 基酸序列 XAETCEXJXJSEQ ID N0:18)和 X5X6KX7XsX9L(SEQ ID N0:19)形成的哺乳动物 C5a构象表位结合，其中Xi选自N、H、D、F、K、Y和T ;X2选自D、L、Y和H ;X3选自Q、E和K ; X4选自A、V和L ;X5选自S、H、P和N ;X6选自H和N ;X7选自D、N、H、P和G ;XS选自M、L、I 和V ;和X9选自Q、L和I。尤其适用于实践本发明的"结合部分"能够与由两条氨基酸序列 NDETCEQRA(SEQ ID N0:2)和 SHKDMQL(SEQ ID N0:3)形成的人 C5a 构象表位结合。
[0023] 如本文所使用，如果第一化合物对第二化合物具有的解离常数&为ImM以下、优 选100 yM以下、优选50 yM以下、优选30 yM以下、优选20 yM以下、优选10 yM以下、优选 5 y M以下、更优选1 y M以下、更优选900nM以下、更优选800nM以下、更优选700nM以下、更 优选600nM以下、更优选500nM以下、更优选400nM以下、更优选300nM以下、更优选200nM 以下、更加优选l〇〇nM以下、更加优选90nM以下、更加优选80nM以下、更加优选70nM以下、 更加优选60nM以下、更加优选50nM以下、更加优选40nM以下、更加优选30nM以下、更加优 选20nM以下和更加优选10nM以下，那么第一化合物（例如，抗体）被认为与所述第二化合 物（例如抗原（例如靶蛋白"结合"。
[0024] 本发明的术语"结合"优选指特异性结合。"特异性结合"意指结合部分（例如抗 体）与靶标（例如对其有特异性的表位）的结合相比于其与另一靶标的结合更强。如果结 合部分与第一靶标结合的解离常数（K d)低于对第二靶标的解离常数，那么结合部分与第一 靶标的结合相比于第二靶标更强。优选地，结合部分特异性结合靶标的解离常数（K d)为结 合部分非特异性结合靶标的解离常数（Kd)的不到1/10,优选不到1/20,更优选不到1/50， 更加优选不到 1/100、1/200、1/500 或 1/1000。
[0025] 本文使用的术语"Kd"（测量为"mol/L"，有时缩写为"M"）旨在指结合部分（例如 抗体或其片段）和靶分子（例如抗原或其表位）之间特定相互作用的解离平衡常数。
[0026] "表位"，亦称为抗原决定簇，是被免疫系统（特别是被抗体、B细胞或T细胞）识别 的大分子的部分。本文使用的"表位"是能够与本文所述的结合部分（例如抗体或其抗原 结合片段）结合的大分子的部分。在本上下文中，术语"结合"优选指特异性结合。表位通 常由分子（例如氨基酸或糖侧链）的化学上活性的表面基团组成并通常具有特定三维结构 特征和特定电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下与前者而不是后 者失去结合。
[0027] 本文使用的"构象表位"指线性大分子（例如多肽）的表位，其由所述大分子的三 维结构形成。在本申请的上下文中，"构象表位"是"不连续表位"，即大分子（例如多肽）上 的构象表位形成自大分子一级序列（例如多肽的氨基酸序列）中的至少两个单独区。换言 之，如果表位由与本发明的结合部分（例如抗体或其抗原结合片段）同时结合的一级序列 中的至少两个单独区组成，其中这些至少两个单独区被一级序列中一个或多个不与本发明 的结合部分结合的区间断，那么该表位在本发明的上下文中被认为是"构象表位"。优选地， 这样的"构象表位"存在于多肽上，且一级序列中的两个单独区是与本发明的结合部分（例 如抗体或其抗原结合片段）结合的两个单独的氨基酸序列，其中这些至少两个单独氨基酸 序列被一级序列中一个或多个不与本发明的结合部分结合的氨基酸序列间断。优选地，间 断氨基酸序列是包含两个以上不与结合部分结合的氨基酸的连续氨基酸序列。与本发明的 结合部分结合的至少两个单独氨基酸序列的长度不特别限制。这样的单独氨基酸序列可仅 由一个氨基酸组成，只要所述至少两个单独氨基酸序列内的氨基酸总数足够大以实现结合 部分与构象表位之间的特异性结合即可。
[0028] "互补位"是识别表位的抗体部分。在本发明的上下文中，"互补位"是如本文所述 的结合部分（例如抗体或其抗原结合片段）的部分，其识别表位。
[0029] 术语"抗体"通常指包含通过二硫键链间连接的至少两条重链（H)和两条轻链（L) 的糖蛋白，或其抗原结合部分。术语"抗体"亦包括所有重组形式的抗体，尤其是本文所述的 抗体，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化抗体和任何如下文所述的结合抗原的抗体 片段和衍生物。各重链由重链可变区（本文缩写为VHSV H)和重链恒定区组成。各轻链由 轻链可变区（本文缩写为VL或\)和轻链恒定区组成。VH和VL区可进一步细分为高变区 (称为互补决定区（CDR))，其被更保守的区（称为框架区（FR))间断。各VH和VL由三个 CDR和四个FR组成，从氨基端向羧基端按下述顺序排列：FR1，CDR1，FR2, CDR2, FR3, CDR3， FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫 球蛋白与宿主组织或因子（包括免疫系统的各种细胞（例如效应细胞）和经典补体系统的 第一成分（Clq))的结合。
[0030] 本文使用的术语抗体的"抗原结合片段"（或简称"结合部分"），指保留与抗原特 异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已显示抗体结合抗原的功能可由全长抗体的片段 完成。术语抗体的"抗原结合部分"内所包含的结合片段的实例包括：⑴Fab片段，为由VL、 VH、CL和CH结构域组成的单价片段；（ii) F (ab'）2片段，为包含在铰链区通过二硫桥连接的 两个Fab片段的二价片段；（iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；（iv)由抗体单臂的VL 和 VH 结构域组成的 Fv 片段；（v)dAb 片段（Ward 等，（1989)Nature 341:544-546)，其由 VH 结构域组成；(vi)分离的互补决定区，和（vii)两个或更多个分离CDR的组合，其任选可通 过合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但是使用重 组方法通过能使它们成为单蛋白链的合成接头可将它们连接，在单蛋白链中VL和VH区配 对来形成单价分子（称为单链Fv(scFv);参见例如Bird等（1988) Science 242:423-426; 和 Huston 等（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体亦旨在被 术语抗体的"抗原结合片段"所涵盖。另一实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含： (i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，（ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重 链CH2恒定区，和（iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合结构域多 肽可为重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白另外在US2003/0118592 和US 2003/0133939中公开。使用本领域技术人员已知的常规技术可获得这些抗体片段， 并按与完整抗体相同的方式筛查片段的效用。"抗原结合片段"的另外实例是所谓的微抗 体（microantibody)，其来源于单⑶R。例如，Heap等，2005描述来源于抗HIV-1的gpl20 包膜糖蛋白的抗体重链CDR3的17个氨基酸残基微抗体。其他实例包括包含两个或更多个 ⑶R区的小抗体模拟物，⑶R区优选通过同源的框架区彼此融合。Qiu等，2007已描述这样 的小抗体模拟物，其包含通过同源的V H FR2连接的VH OTR1和\ OTR3。
[0031] 因此，本文使用的术语"抗体或其抗原结合片段"指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白 分子的免疫活性部分，即包含与抗原免疫特异性结合的抗原结合位点的分子。还包括的是 通过技术（包括，例如噬菌体展示）选择以与靶分子或靶表位特异性结合的免疫球蛋白样 蛋白，例如与由氨基酸序列XAETCEXJXJSEQ ID N0:18)和X5X6KX7XsX9L(SEQ ID N0:19)形 成的C5a构象表位特异性结合，其中Xi选自^、0^、￥和1'32选自0、1^、￥和1^ 3选自 Q、E和K ;X4选自A、V和L ;X5选自S、H、P和N ;X6选自H和N ;X7选自D、N、H、P和G ;父8选 自M、L、I和V ;和X9选自Q、L和I ;或与由根据SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的氨基酸序列 形成的人C5a构象表位特异性结合；或与由氨基酸序列DETCEQR(SEQ ID N0:4)和KDM形成 的人C5a构象表位特异性结合。本发明的免疫球蛋白分子可为任何型（例如IgG、IgE、IgM、 IgD、IgA 和 IgY)、类（例如 IgGl、IgG2(优选 IgG2a 和 IgG2b)、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2) 或免疫球蛋白分子的亚类。
[0032] 在本发明中使用的抗体及其抗原结合片段可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳 动物。优选地，抗体或片段来自人、黑猩猩、啮齿动物（例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔）、鸡、火 鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗来源。特别优选抗体是人或鼠来源。本发明的 抗体也包括嵌合分子，其中来源于一种物种（优选为人）的抗体恒定区与来源于另一物种 (例如小鼠）的抗原结合位点组合。此外，本发明的抗体包括人源化分子，其中来自非人物 种（例如来自小鼠）的抗体的抗原结合位点与人来源的恒定区和框架区组合。
[0033] 如本文所例示，本发明的抗体可直接获自表达抗体的杂交瘤，或者可在宿主细胞 (例如CH0细胞或淋巴细胞）中克隆和重组表达。宿主细胞的另外实例是微生物，例如大 肠杆菌（E.coli)和真菌（例如酵母）。备选地，它们可在转基因非人动物或植物中重组产 生。
[0034] 术语"嵌合抗体"指，其中重链和轻链的各氨基酸序列的一部分与来源于特定物种 或属于特定种类的抗体中相应的序列同源，而剩下的链的区段与另一物种或种类中的相应 的序列同源的那些抗体。通常轻链和重链两者的可变区模拟来源于一种哺乳动物物种的抗 体可变区，而恒定部分与来源于另一哺乳动物物种的抗体序列同源。这种嵌合形式的一个 明显优势是，使用来自非人宿主生物体的可容易获得的B细胞或杂交瘤结合来自例如人细 胞制备物的恒定区，可合宜地从目前已知的来源获得可变区。虽然可变区具有容易制备的 优势和特异性不受来源影响，但是当注射抗体时，与来自非人来源的恒定区相比，人的恒定 区引起来自人受试者的免疫应答的可能性低。然而，该定义不限于本特定实例。
[0035] 术语"人源化抗体"指，具有实质上来源于来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合 位点的分子，其中分子剩下的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白结构和/或序列。抗原 结合位点可包含融合在恒定结构域上的完整可变结构域或仅在可变结构域中移植在合适 框架区上的互补决定区（CDR)。抗原结合位点可为野生型或通过一个或多个氨基酸置换修 饰，例如修饰以更加接近地类似于人免疫球蛋白。一些形式的人源化抗体保留所有CDR序 列（例如人源化小鼠抗体，其包含来自小鼠抗体的所有六个CDR)。其他形式相对于原始抗 体具有一个或多个改变的CDR。
[0036] 用于人源化抗体的不同方法对技术人员是已知的，如由Almagro和 Fransson, 2008综述，其内容通过引用以其整体结合到本文中。Almagro和Fransson