A
[0032] -、设计靶序列以及识别靶序列的sgRNA
[0033] 绵羊FecB基因如序列表的序列1所示（开放阅读框为自5'末端第157-1665位 核苷酸），其编码的蛋白质如序列表的序列2所示。
[0034] 设计sgRNA针对绵羊FecB基因的靶序列（序列表的序列3,该靶序列在绵羊FecB 基因的外显子 8 上）：5' -AGAITGGAAAAGGTCGCTAT-3'。
[0035] 设计针对上述靶序列的sgRNA，即sgRNA-1 (序列表的序列4):
[0036] 5' -AGAUUGGAAAAGGUCGCUAUGGG-3、
[0037]二、制备 sgRNA
[0038] 1、用限制性内切酶Bbsl酶单酶切px330质粒，然后进行1 %琼脂糖凝胶电泳（酶 切产物的1%琼脂糖凝胶电泳图见图1)，然后回收并纯化线性化的质粒。
[0039] 2、将步骤1的纯化产物进行去磷酸化。
[0040] 3、将引物FecB-CF和引物FecB-CR退火，得到两端均为粘末端的双链DNA分子。
[0041] 4、将步骤2的产物与步骤3得到的双链DNA分子连接，得到重组质粒。
[0042] 5、以步骤4得到的重组质粒为模板，采用FecB-TF和FecB-TR组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物的2%琼脂糖凝胶电泳图见图2。经测序，PCR 扩增产物如序列表的序列5所示。
[0043] 6、取步骤5得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒（MEGAshortscript? T7Kit，Life Technologies公司，货号为AM1354)进行体外转录，然后采用RNA纯化试剂盒 纯化回收，得到sgRNA-2。sgRNA-2的凝胶电泳图见图3。sgRNA-2如序列表的序列6所示。 sgRNA-2自5'末端第2至21位核苷酸对应sgRNA-1。
[0044]三、制备CastoRNA
[0045] 1、以px330质粒为模板，采用Cas9_F (下划线标注T7启动子）和Cas9_R组成的引 物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（4311bp)。PCR扩增产物的电泳图见图4。经测序， PCR扩增产物如序列表的序列7所示。序列表的序列7中，自5'末端第24-4295为Cas9的 开放阅读框。编码序列表的序列8所示的Cas9蛋白。
[0046] Cas9-F :5' -TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3'；
[0047]Cas9-R:5 ' -GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3 '〇
[0048] 2、取步骤1得到的PCR扩增产物，利用体外转录试剂盒（Life Technologies公司 的mMSSS私EmMACHOT?T7 Ultra Kit，货号为AM1345)进行体外转录，然后采用RNA纯化 试剂盒纯化回收，得到Cas9mRNA。Cas9mRNA的凝胶电泳图见图5。Cas9mRNA如序列表的序 列9所示。Cas9mRNA自5'末端第7至4278位核苷酸为编码区。
[0049] 实施例2、sgRNA/Cas9mRNA突变效率检测
[0050] -、绵羊受精卵的获得
[0051] 1、卵母细胞的成熟
[0052] 从屠宰场采集绵羊卵巢（卵巢来自哈萨克羊），用注射器从卵巢表面直径为2-5_ 的卵泡中抽取卵母细胞，在显微镜下挑选出卵母细胞，置于38. 6°(：、5%0)2培养箱内进行成 熟培养。
[0053] 2、卵母细胞的体外受精
[0054] (1)将体外成熟24_26h的卵母细胞用0.1 %透明质酸酶轻轻吹打以除去颗粒细 胞，再用受精液（受精液：S0F液+体积百分含量为20 %的发情羊血清+6IU/mL肝素钠 +100IU/mL庆大霉素）洗涤3次，然后放入平衡好的受精液滴内（每个受精液滴为50 y L受 精液，放入20-30枚卵母细胞）。平衡好的受精液滴的制备方法：将受精液滴在含5 % 0)2的 38. 6 °C培养箱中，放置3-4个小时。
[0055] (2)取冷冻的精液（精液来自哈萨克羊），解冻，然后放入38.6 °C培养箱中 15-20min (有活力的精子会向上游），然后吸取上部的精液，离心5min，然后轻轻吹打混匀， 得到精子混悬液（对精子混悬液进行精子计数）。
[0056] (3)将步骤⑵得到的精子混悬液加入完成步骤⑴的受精液滴中，使精子的浓 度为2X 106个/mL，38. 6°C静置孵育12h，然后用平衡好的体外培养液（体外培养液配方： TCM199培养液+体积百分含量为20 %的发情羊血清+10 y g/mL 0 -巯基乙醇+10 y g/mL FSH+10 y g/mL LH+1 y g/mL雌激素）反复吹吸受精卵，然后按50枚/孔的密度移入四孔培 养板内。平衡好的体外培养液的制备方法：将体外培养液在含5% 0)2的37°C培养箱中，放 置3-4个小时。
[0057] 受精后48h统计卵裂率，第8d统计囊胚率。
[0058] 二、单细胞期受精卵的显微注射
[0059] 1、将实施例1制备的sgRNA-2、实施例1制备的Cas9mRNA混合，用Nuclease-free Water稀释，得到混合液。混合液中，sgRNA-2的浓度为50ng/ y L，Cas9mRNA的浓度为100ng/ y L〇
[0060] 2、试验处理：采用NIKON公司的显微注射仪将步骤1得到的混合液注射入步骤一 得到的处于单细胞期的受精卵的胞质内，置于38. 6°C、5% C02培养箱中培养。对照处理：采 用NIKON公司的显微注射仪将无RNase水注射入步骤一得到的处于单细胞期的受精卵的胞 质内，置于38. 6°C、5% 0)2培养箱中培养。
[0061] 3、受精卵突变检测
[0062] (1)胚胎样品收集
[0063] 步骤2中培养7天后，取胚胎，用PBS缓冲液洗涤2遍，然后置于5 y L裂解液中，瞬 时离心后37°C裂解3h。裂解液：溶剂为Tris-HCl (50mM、pH8. 0)，含0. 5% (体积比）Triton X-100 和 lmg/mL Proteinase K〇
[0064] (2)PCR扩增
[0065] 以步骤⑴的裂解产物为模板，进行巣式PCR。巣式PCR中，第一轮PCR扩增采用 FecB-Fl和FecB-Rl组成的引物对，第二轮PCR扩增采用FecB-F2和FecB-Rl组成的引物 对。巣式PCR产物的电泳图见图6 (片段长度为538bp)。
[0066] (3)T7核酸内切酶I (T7E1)鉴定
[0067] 将试验处理步骤（2)得到的PCR产物和对照处理步骤（2)得到的PCR产物进行 变性退火，形成异源杂交双链。反应程序：95°C 10min ;85°C、75°C、65°C、55°C、45°C、35°C、 25°C各lmin(每个温度梯度降温速率为0? 3°C /s) ;10°C Pause。
[0068] 得到异源杂交双链后，在体系中加入T7E1酶（购自美国NEB公司），37°C反应 30min，然后进行2%的琼脂糖电泳，结果见图7。
[0069] 箭头指示试验处理出现两条切割条带（大约215bp和323bp)，而对照处理未见切 割条带，证明DNA分子被Cas9和sgRNA特异性编辑。
[0070] (4) TA克隆测序比对
[0071] 将T7E1酶切为阳性的PCR产物测序，分析胚胎发生编辑效率为38%(见表2)。
[0072] 将上述酶切为阳性的PCR产物克隆至pMD-19T载体，随机挑取9-10个单克隆测序 来精确定位突变位点。部分发生突变的胚胎的结果见表3 (突变类型指的是存在几种突变 形式）和图8 (序列后的注释形式为"n/m"，n表示该编辑形式数量，m表示所挑取的单克隆 总数）。sgRNA-2和Cas9mRNA在绵羊胚胎中能高效特异地靶向修饰FecB基因，而且突变的 类型主要为单碱基插入或小片段删除。其中46个单克隆中31个克隆发生了突变且切割位 点均毗邻PAM序列，这31个突变克隆中包含4种突变形式，最长、最短的删除片段分别为 16bp、6bp，也有一部分克隆含有单碱基插入，这些结果证明了 CRISPR/Cas9在绵羊受精卵 中可以特异性的切割DNA，为制作基因敲除动物奠定了基础。
[0073] 表2 CRISPR/Cas9靶向删除FecB基因mRNA显微注射绵羊体外胚胎结果
[0074]
[0075] 表3 CRISPR/Cas9靶向删除FecB基因胚胎单克隆测序比对结果
[0076]
【主权项】
1. 一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA，为序列表的序列4自5'末端第 1至20位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5'末端第1至20位核苷酸的RNA。2. 如权利要求1所述的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA为序列表的序列4所示的RNA 或序列表的序列6所示的RNA。3. 编码权利要求1所述sgRNA的DNA分子。4. 如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为序列表的序列3所示 的DNA分子或序列表的序列5所不的DNA分子。5. 含有权利要求3或4所述DNA分子的重组载体。6. -种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的靶向序列，如序列表的序列3所示。7. -种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括权利要求1或2所述的sgRNA。8. -种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括编码权利要求1或2所述sgRNA的 DNA分子。9. 一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括含有编码权利要求1或2所述的 sgRNA的DNA分子的重组质粒。10. -种特异性敲除绵羊FecB基因的方法，是将权利要求1或2所述的sgRNA和 Cas9mRNA共转染绵羊细胞，从而敲除绵羊FecB基因。
【专利摘要】本发明公开了一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA。本发明首先提供了一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA，为序列表的序列4自5’末端第1至20位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5’末端第1至20位核苷酸的RNA。采用本发明提供的sgRNA和Cas9mRNA，可以借助CRISPR/Cas9基因组编辑技术在绵羊胚胎上对FecB基因进行定向修饰和改造，大大缩短育种时间，加快育种进程，提高绵羊繁殖力，为下一步通过受精卵注射和胚胎移植开展绵羊基因组编辑育种奠定基础，同时为今后利用含有高繁殖力FecB基因的杂种母羊和杂种公羊建立肉用多胎绵羊核心群，加速绵羊多胎品系的选育步伐有深远意义。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/85, C12N15/11
【公开号】CN105039339
【申请号】CN201510305307
【发明人】刘明军, 张雪梅, 彭新荣, 娄变, 吴阳升, 李文蓉
【申请人】新疆畜牧科学院生物技术研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月5日