PCR，分别对六对特异性荧光定量PCR引物的特异性进行PCR检测；
[0045] 其中，PCR 体系 50 y L :10Xbuffer 5 y L ;DNTPs 5 y L ;上游引物 20 ymol/L lyL;下游引物20ymol/L lyL;Taq DNApolymerase 250U 0.5yL;模板 DNA lyL;ddH20 36. 5 u L；
[0046] PCR程序如下：①94°C预变性3min ;②94°C变性30s ;③60°C变性30s ;④72°C延 伸30s ;⑤②~④循环30次；⑥72°C延伸2min ;对扩增产物进行琼脂糖电泳，如果一种乳杆 菌引物只特异性扩增出相应的菌种基因组中的DNA片段，不扩增出其他菌种DNA片段，即表 明该特异性荧光定量PCR引物具有较好扩增特异性，能抵抗同属不同种乳杆菌的干扰，能 够用于后期定量检测。
[0047] 而且，所述步骤⑵中的奠便中细菌基因组的提取采用FastDNA Spin Kit for Soil 试剂盒提取粪便基因组，具体操作方法如下：
[0048] ①称取100-200mg粪便样品于裂解介质管中，加入978ul磷酸盐缓冲液和122ul MT缓冲液；
[0049] ②将裂解介质管在快速核酸提取仪上破碎、混匀，以6m/s的速度处理20s，处理2 次；
[0050] ③将裂解介质管于14000G的转速下离心5-10min，以破碎菌体；取离心的上清转 移至干净的2ml离心管中，加入250ul PPS溶液，于手中振荡10次混匀；
[0051] ④将2ml离心管于14000G的转速下离心5min，之后转移上清至干净的15ml离心 管中；
[0052] ⑤重悬娃土结合液之后加入1ml至上述15ml离心管中；在振荡器上振荡2min使 硅土与DNA结合，静置3min使硅土沉淀；
[0053] ⑥小心地吸除500ul上清，避免接触到硅土结合液；重悬剩余的硅土结合液和残 余的上清，转移600ul重悬的液体至过滤管中，14000G离心lmin，清空接收管中液体，加入 剩余的硅土结合液和残余的上清并离心，清空接收管中液体；
[0054] ⑦加入500ul采用无水乙醇稀释8倍后的盐酸乙醇洗脱母液，用移液器吹打均匀； 之后于14000G条件下离心lmin，清空接收管，重复离心一次，以去除剩余液体；
[0055] ⑧将过滤管换到新的接收管中，室温干燥5min ;
[0056] ⑨加入50-100ul DNA洗脱液溶液，14000G离心lmin，得到粪便基因组，于-20°C保 存，备用。
[0057] 而且，所述步骤⑷中以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，PCR体系20ul : 2XSYBR染料预混液10ul ;上游引物lul ;下游引物lul ;DNA模板lul ;ddH20 lul ;PCR程序 如下：①95°C预变性3min ;②95°C变性5s ;③60°C变性30s ;④72°C延伸10s ;⑤步骤②~ 步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65°C -95°C，0. 5°C /2-5s。
[0058] 而且，所述步骤(5)中荧光定量PCR扩增的具体操作步骤如下：
[0059] PCR体系20ul :2 X SYBR染料预混液10ul ;上游引物lul ;下游引物lul ;DNA模 板lul ;ddH20 lul ;PCR程序如下：①95°C预变性3min ;②95°C变性5s ;③60°C变性30s ; ④72°C延伸10s ;⑤步骤②~步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65°C -95°C，0. 5°C /2-5s。
[0060] 而且，所述步骤(6)的具体判断方法如下：
[0061] 将停止摄入乳杆菌后2~14天的受试者粪便中各种乳杆菌的量，与摄入乳杆菌之 前的水平进行比较，高于之前的菌量即表示定植，由此能够得到每株乳杆菌的肠道定植时 间，进一步地能够定量比较每株菌的定植量。
[0062] 本发明取得的优点和有益效果是：
[0063] 本发明针对六种应用较为广泛的乳杆菌一植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、 鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌的肠道定植能力进行测定，创新性地利用实 验对象摄入六种或几种混合菌株，收集摄入前后的实验对象粪便，对粪便进行荧光定量检 测就可以批量分析多种菌在肠道的定植情况，大大减少了实验周期，并节约实验动物资源； 同时荧光定量检测分析对分子操作技术要求不高，可简单、快捷操作，动物实验结束后从粪 便提取到数据分析，只需要4-5h便可完成；该发明方法检测精准度高，能准确定量粪便样 品中的乳杆菌的量，可以在分析菌株定植时间的同时准确分析菌株的定植量；是一种可行 的能够广泛推广的菌株肠道定植能力测定方法。
【附图说明】
[0064] 图1为本发明中六种乳杆菌相应的荧光定量PCR引物特异性检测的琼脂糖电泳 图；
[0065] 其中，图1-1为鼠李糖乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L9模 板分别为鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、发酵 乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热链球菌；
[0066] 图1-2为干酪乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L11模板分别 为干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植 物乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热链球菌；
[0067] 图1-3为保加利亚乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L9模板 分别为保加利亚乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆 菌、鼠李糖乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热链球菌；
[0068] 图1-4为发酵乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，Ll-L9模板分别为 发酵乳杆菌、发酵乳杆菌、发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳 杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌；
[0069] 图1-5为植物乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L11模板分 别为保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、解淀粉芽孢杆 菌、植物乳杆菌、植物乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、格氏乳杆菌；
[0070] 图1-6为瑞士乳杆菌引物特异性测试图，其中最左边为Marker，L1-L11模板分别 为保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、瑞 士乳杆菌、瑞士乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热链球菌、格氏乳杆菌；
[0071] 图2为本发明六种乳杆菌拷贝数与ct值之间的标准曲线图；其中，图2-1为发酵 乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，图2-2为鼠李糖乳杆菌的实时荧光定量PCR 标准曲线图；其中，图2-3为保加利亚乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，图2-4 为瑞士酵乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；其中，图2-5为植物乳杆菌的实时荧光定 量PCR标准曲线图；其中，图2-6为干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR标准曲线图；
[0072] 图3为本发明六种乳杆菌的六对特异性荧光定量PCR引物的荧光定量PCR熔解曲 线图；其中，图3-1为保加利亚乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；图3-2为发酵乳杆 菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；图3-3为瑞士乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图； 图3-4为干酪乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；图3-5为鼠李糖乳杆菌的实时荧光 定量PCR熔解曲线图；图3-6为植物乳杆菌的实时荧光定量PCR熔解曲线图；
[0073] 图4为本发明中不同时期粪便样品的扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0074] 下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0075] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的 方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0076] 本发明中混合菌液/菌粉为含有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳 杆菌、瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌的混合菌液/菌粉。
[0077] 本发明中可以采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取奠便基因组，其方法 如下：
[0078] ①称取100_200mg奠便样品于Lysing Matrix E(裂解介质）管中，加入978ul Sodium phosphate Buffer (磷酸盐缓冲液）和 l22ul MT Buffer (缓冲液）；
[0079] ②将Lysing Matrix E (裂解介质）管在快速核酸提取仪上破碎、混勾，以6m/s的 速度处理20s，处理2次；
[0080] ③将Lysing Matrix E (裂解介质）管于14000G的转速下离心5-10min，以破碎 菌体；取离心的上清转移至干净的2ml离心管中，加入250ul PPS溶液，于手中振荡10次混 匀；
[0081] ④将2ml离心管于14000G的转速下离心5min，之后转移上清至干净的15ml离心 管中；
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