] ⑤重悬Binding Matrix Suspension (娃土结合液）之后加入lml至上述15ml离 心管中；在振荡器上振荡2min使娃土与DNA结合，静置3min使娃土沉淀；
[0083] ⑥小心地吸除500ul上清，避免接触到硅土结合液；重悬剩余的硅土结合液和残 余的上清，转移600ul重悬的液体至过滤管中，14000G离心lmin，清空接收管中液体，加入 剩余的硅土结合液和残余的上清并离心，清空接收管中液体；
[0084] ⑦加入500ul采用无水乙醇稀释8倍后的盐酸乙醇洗脱母液，用移液器吹打均匀； 之后于14000G条件下离心lmin，清空接收管，重复离心一次，以去除剩余液体；
[0085] ⑧将SPIN Filte (过滤管）换到新的接收管中，室温干燥5min ;
[0086]⑨加入50-100ul DES溶液（DNA洗脱液），14000G离心lmin，得到粪便基因组， 于-20°C保存，备用。
[0087] 所述以稀释后的产物为模板进行荧光定量PCR，PCR体系20ul :2XSYBR Green Supermix (染料预混液）10ul ;上游引物lul ;下游引物lul ;DNA模板lul ;ddH20 lul ;PCR 程序如下：①95°C预变性3min ;②95°C变性5s ;③60°C变性30s ;④72°C延伸10s;⑤步骤 ②~步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65°C -95°C，0. 5°C /2-5s。
[0088] 本发明中对六对特异性荧光定量PCR引物的扩增特异性的检测可以采用如下方 法，步骤如下：
[0089] 第一步：准备六种乳杆菌的纯培养物，进行细菌基因组的提取，细菌基因组提取方 法如下：①取培养过夜后的六种菌液l-2ml至EP管中，10000r/min离心2min，弃上清得菌 体；
[0090] ②加入l_2ml无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
[0091] ③加入200ul SDS裂解液，混匀后在65-80°C恒温保温20-30min ;
[0092] ④加入200-300ul酚-氯仿于菌体裂解液中，颠倒混匀后12000r/min离心 5-lOmin，取上清 200ul ;
[0093] ⑤加入400-500ul冰乙醇于200ul上清液中，-20°C静止30-50min之后，12000r/ min离心5-10min，弃上清；
[0094] ?加入500111 70%冰乙醇重悬沉淀，1200(^/111111离心1-3111111，弃上清，常温干燥；
[0095] ⑦用50-100ul ddH20溶解沉淀，即得乳杆菌基因组，之后于_20°C保存、备用；
[0096] 第二步：以得到的乳杆菌基因组为模板，采用六对特异性荧光定量PCR引物进行 普通PCR，分别对六对特异性荧光定量PCR引物的特异性进行PCR检测；
[0097]其中，PCR体系50 y L :10Xbuffer 5 y L ;DNTPs 5 y L ;上游引物（20 ymol/ L) 1 y L ;下游引物（20 y mol/L) 1 y L ;Taq DNApolymerase (250U) 0? 5 y L;模板DNA 1 y L ; ddH20 36. 5 y L；
[0098] PCR程序如下：①94°C预变性3min;②94°C变性30s;③60°C变性30s;④72°C延 伸30s ;⑤②~④循环30次；⑥72°C延伸2min ;对扩增产物进行琼脂糖电泳，如果一种乳杆 菌引物只特异性扩增出相应的菌种基因组中的DNA片段，不扩增出其他菌种DNA片段，即表 明该特异性荧光定量PCR引物具有较好扩增特异性，能抵抗同属不同种乳杆菌的干扰，能 够用于后期定量检测。
[0099] 实施例1乳杆菌在小鼠肠道定植能力测定
[0100] 采用SPF(无特定病原体动物）级小鼠为实验模型，通过灌胃混合菌液及后期收 集、检测粪便中这六种菌的量来测定小鼠在肠道的定植能力。
[0101] (1)分别制备植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌和 保加利亚乳杆菌这六种乳杆菌菌粉，平板计数计算菌粉中活菌数，制备含有六种乳杆菌的 混合菌粉，保证其中每种菌的浓度相同，混合菌粉于-20°c保存备用。
[0102] (2)购买4-6周龄SPF级小鼠，于实验动物中心屏障环境饲养，试验分为两个组，每 组8只小鼠，一组为实验组，每只小鼠每天灌胃200ul分别含有10 SCFU的六种乳杆菌的混 合菌液，另外一组为对照组，每只每天灌胃200ul的脱脂乳，试验周期为14天。收集灌胃前 及灌胃停止后4、6、8、10、12、14天的小鼠粪便，于-80°C保存，备用。
[0103] (3)准确称取100mg步骤（2)中所述小鼠粪便样品，采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取粪便基因组。
[0104] (4)通过NCBI检索得到植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞 士乳杆菌、保加利亚乳杆菌等乳杆菌的16SrRNA序列，通过比对这些序列，找到一种乳杆菌 与其他乳杆菌有差异的可变区序列，根据这些序列采用premierf. 0软件设计特异性引物， 使用该引物能特异性的扩增出该种类的乳杆菌，达到定量检测的目的，采用常规PCR检测 其特异性；
[0105] 其中，PCR模板分别为六种乳杆菌的细菌基因组，其中PCR体系50 y L : 10 X buffer 5 y L ;DNTP 5 y L ;上游引物（20 y mol/L) 1 y L ;下游引物（20 y mol/L) 1 y L ;Taq DNA polymerase (250U) 0? 5 y L ;模板 DNA 1 y L ;ddH20 36. 5 y L。PCR 程序如下：① 94°C预变性 3min ;②94°C变性30s ;③60°C变性30s ;④72°C延伸30s ;⑤②~④循环30次；⑥72°C延 伸2min ;对扩增产物进行琼脂糖电泳，电泳图见附图1，由图1可知，六对引物均具有较好的 特异性。
[0106] (5)采用上述的六种乳杆菌的基因组为模板，分别采用相应的特异性引物进行普 通PCR，对得到的PCR产物进行切胶回收，测定回收产物的浓度，将浓度换算成拷贝数，DNA 浓度与拷贝数之间的换算公式如下：
[0107] Copies/ul=6. 02*1023* [ (ng/ul*10 9) / (size in bp*660)]，
[0108] 之后将回收产物梯度稀释，使其拷贝数在1〇2-1〇1(]之间。以梯度稀释后的产物为 模板进行荧光定量PCR;
[0109] 其中，荧光定量 PCR 体系 20ul :2XSYBR Green Supermix 10ul ;上游引物 lul ; 下游引物lul ;模板lul ;ddH20 lul ;PCR程序如下：①95°C预变性3min ;②95°C变性5s ; ③60°C变性30s ;④72°C延伸10s ;⑤步骤②~步骤④循环40次；⑥熔解曲线，65°C _95°C， 0. 5°C /2-5s ;以拷贝数和得到的稀释样品ct值制作标准曲线，同时观察六种引物的熔解曲 线中峰是否为单一峰，是则说明该引物能够特异性扩增出单一的片段，六种乳杆菌的标准 曲线和熔解曲线分别见附图2、附图3,由图3可以看到六种引物的荧光定量PCR产物均具 有单一的熔解峰，表明六对引物具有良好的扩增特异性，可用于后期的荧光定量实验。
[0110] (6)以粪便基因组为模板，采用表1中六种引物进行荧光定量PCR反应，每个粪便 样品基因组分别采用六种引物进行荧光定量，每个反应做三个平行，检测结果如图4所示， 由图可以看出，大部分的样品的ct值在10-25之间，属于有效数据，就可以用于定量分析。
[0111] (7)将以不同粪便样品荧光定量得到的ct值带入相应的标准曲线中计算出拷贝 数，换算成每克粪便中的量，不同阶段粪便中六种菌的含量见表2,比较同一种菌在灌胃结 束后4、6、8、10、12、14天与灌胃之前的量，若前者高于后者表明该菌至少定植至当天，同时 可比较不同菌的定植量，分析定植能力。由表2中数据可看出各菌的肠道定植时间，在喂 食小鼠的六种菌中，植物乳杆菌的量在停止摄入菌粉14天后依然保持在7. 02±0. 34(lg 拷贝数/g粪便），相较未摄入菌粉前的6. 02±0. 79 (lg拷贝数/g粪便）来说，提高了一 个数量级，表明植物乳杆菌P1菌能够以高出原始菌量一个数量级的水平定植肠道14天， 分析其他数据可知干酪乳杆菌C1也有相同的定植趋势，这两株菌在六株菌中具有最好的 肠道定植能力；而发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌的量在停止摄入菌粉后的两周内，都在初始量 6. 16±0. 16、7. 6±0. 22 (lg拷贝数/g奠便）左右波动，表明发酵乳杆菌F1和瑞士乳杆菌 H1分别以较低的定植量于小鼠肠道中定植12天和8天，具有较弱的肠道定植能力，而保加 利亚乳杆菌B1及鼠李糖乳杆菌R1以较低的定植量定植14天。实验结果说明本发明可以 方便、快捷的测定多种菌株的肠道定植天数与定植量。
[0112] 实施例2乳杆菌在人体肠道定植能力测定
[0113] 采用健康成人为实验对象，