使用hb9调节子使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法
【专利说明】使用HB9调节子使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的 方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求美国临时申请61/747, 672 (2012年12月31日提交）的优先权，该美 国临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明所属领域为细胞分化领域。更具体地，本发明涉及将特定的甲状腺激素或 其类似物、和ALK5抑制剂用作胰腺内胚层和内分泌细胞的HB9调节子。
【背景技术】
[0004] I型糖尿病的细胞替代疗法在不断推进，同时可移植胰岛又一直短缺，这使人们重 点着眼于扩大适于移植产胰岛素细胞（即0细胞）的来源。一种方法是由多能干细胞（例 如胚胎干细胞）产生功能性0细胞。
[0005] 在脊椎动物的胚胎发育期间，多能细胞在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个 胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的细胞群。例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织 将从内胚层经由中间阶段发育产生。原肠胚形成的中间阶段涉及形成定形内胚层。
[0006] 到原肠胚形成结束时，内胚层分裂成了前、中、后三个区域，可通过检测一组独特 标记内胚层这三个区域的因子的表达水平来识别这些区域。例如，HHEX和S0X2是内胚层 前区的独特标记物；而CDX1、CDX2和CDX4是内胚层后区的独特标记物。
[0007] 内胚层组织迀移使内胚层与不同的中胚层组织紧密靠近，从而有助于肠管分区。 肠管分区在多种分泌因子例如FGF、WNT、TGF-e、视黄酸（RA)、BMP配体和它们的拮抗物的 作用下实现。例如，FGF4和BMP促进预定后肠内胚层中的CDX2表达并阻遏前基因HHEX和 S0X2 的表达（2000 Development，127 :1563-1567)。还证明了 WNT 信号转导与 FGF 信号转 导并存，能够刺激后肠发育并控制前肠命运（2007 Development，134:2207-2217)。最后， 间充质分泌的视黄酸调节前肠与后肠的边界（2002 Curr Biol，12:1215-1220)。
[0008] 可利用特异性转录因子的表达水平来判断组织的种类。在定形内胚层转化为原肠 管期间，肠管在大范围内逐渐分区，形成多个区域。技术人员可通过识别这些区域的有限基 因表达模式，在分子水平上观察到这些区域。肠管中分区的胰腺域显示出roxi有极高表 达，但⑶X2和S0X2的表达却非常低。PDX1、NKX6. 1、PTF1A和NKX2. 2在胰腺组织内高度表 达，⑶X2在肠组织内高度表达。
[0009] 胰腺形成源于定形内胚层分化成胰腺内胚层。背侧和腹侧胰腺域衍生自前肠上皮 组织。前肠还会分化成食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝和胆管系统。
[0010] 胰腺内胚层细胞会表达胰十二指肠同源盒基因roxi。没有roxi时，胰腺在形成腹 胰芽和背胰芽后便不再发育。因而，PDX1表达是胰腺器官形成中至关重要的一步。成熟胰 腺由胰腺内胚层分化产生的外分泌组织和内分泌组织构成。
[0011] D'Amour等人描述了向人胚胎干细胞的培养基中加入高浓度活化素和少量血 清，由此制得源于人胚胎干细胞的定形内胚层的富集培养物（Nature Biotechnology 2005,23 :1534-1541 ;美国专利7,704,738)。据报道，在把这些定形内胚层细胞移植到 小鼠的肾包膜下之后，这些细胞会分化成具有内胚层组织特征的更成熟细胞（美国专利 7, 704, 738)。在添加FGF10和视黄酸后，这些衍生自人胚胎干细胞的定形内胚层细胞还可 进一步分化成H)X1阳性细胞（美国专利申请公布2005/0266554)。接下来将这些胰腺前体 细胞移植到免疫缺陷小鼠的脂肪垫中，在三至四个月的成熟期后，便得到了功能性胰腺内 分泌细胞（美国专利7, 993, 920和美国专利7, 534, 608)。
[0012] Fisk等人报道了 一种由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的体系（美国专利 7, 033, 831)。在这种情况下，分化途径分三个阶段。首先使用丁酸钠和活化素A的组合， 使人胚胎干细胞分化成内胚层（美国专利7, 326, 572)。然后将这些细胞与结合了 EGF或 细胞素的BMP拮抗物（如头蛋白（Noggin)) -起培养，得到H)X1阳性细胞。用烟酰胺 诱导终末分化。
[0013] -直以来，技术人员还使用小分子抑制剂来诱导胰腺内分泌前体细胞产生。例 如，已使用TGF-0受体和BMP受体的小分子抑制剂（Development 2011，138 :861-871 ; Diabetes 2011,60:239-247)来显著增加胰腺内分泌细胞的数量。另外，还使用小分子活 化剂来生成定形内胚层细胞或胰腺前体细胞（Curr Opin Cell Biol 2009,21:727-732; Nature Chem Biol2009,5:258-265)。
[0014] HB9 (也称为H1XB9和MNX1)是一种在胰腺发育（从胚胎期大约第八天开始）早 期表达的bHLH转录活化因子蛋白。HB9也在脊索和脊髓中表达。在胚胎期的第十天半左 右，HB9在胰腺上皮中表达H)X1和NKX6. 1的细胞内瞬时表达，水平达到峰值。HB9表达 在第十二天半左右开始衰退，且在胰腺发育后期，只局限于0细胞内。H1XB9无效突变纯 合的小鼠未能发育出胰腺背叶（Nat Genet 23:67-70,1999 ;Nat Genet 23:71-75，1999)〇 HB9-/-P -细胞只表达低浓度的葡萄糖转运蛋白GLUT2和NKX6. 1。此外，HB9-/-胰腺显示 胰岛素阳性细胞数目明显减少，但这种细胞数目减少并未显著影响其他胰腺激素的表达水 平。时序控制HB9对于0细胞正常发并具有正常功能是至关重要的。虽然我们不太清楚 有哪些因子调节HB9在0细胞中的表达，但近期用斑马鱼作的研究揭示，视黄酸可能对HB9 表达有正向调节作用（Development，138,4597-4608, 2011)。
[0015] 四碘甲状腺原氨酸（"T4"）和三碘甲状腺原氨酸（"T3"），它们是由甲状腺分泌 的基于酪氨酸的激素，主要负责调节机体代谢。血液循环中的甲状腺激素大多为T4, T4的 半衰期比T3长。释放入血的T4和T3的比例大约为20比1。T4在细胞中会被脱碘酶转化 为活性较强的T3 (T3的活性是T4的三至四倍）。
[0016]T3随后结合到甲状腺激素受体TRal和TRP1(统称TR)上。甲状腺激素受体 (TR)是一种核激素受体，能与类视色素X受体结合，形成异源二聚体。没有配体时，这种异 源二聚体便结合到甲状腺应答元件（TRE)上，充当转录抑制子。T3结合到TR减轻了 TRE依 赖性基因所受抑制，随后活化各种靶基因表达。虽然多项研究的结果已揭示T3能够增进0 细胞增殖、减少细胞凋亡并促进胰岛素分泌，但目前仍不明确T3在细胞分化过程中所起的 作用。
[0017] 转化生长因子0 (TGF-0)是参与多种生物过程的一大家族多效性细胞因子的成 员，这些生物过程包括控制细胞生长、分化和迀移，维持细胞活性，促进细胞纤维化，和促进 细胞发育命运的特化。TGF-0超家族的成员利用由II型受体和I型受体构成的受体复合 物传导信号。TGF-B配体（例如活化素和GDF(生长分化因子））将II型受体与I型受体拉 到一起形成复合物。该复合物中的II型受体随后磷酸化I型受体，使I型受体活化。哺乳 动物体内有五种11型受体，分别为1'01?-11)(^1?-11)(^1?-118、81〇^-11和41〇^-11 ;和七 种I型受体（ALK1到ALK7)。活化素和相关配体利用ActR-II与ALK4或ALK5的组合，或 ActR-IIB与ALK4或ALK5的组合来传导信号；BMP利用ALK2、ALK3和ALK6与ActR-II的组 合，ALK2、ALK3 和 ALK6 与 ActR-IIB 的组合，或 ALK2、ALK3 和 ALK6 与 BMPR-II 的组合来传 导信号。AMH利用AMHR-II与ALK6的复合物来传导信号；另外，最近的研究结果已显示，节 点利用ActR-IIB与ALK7的复合物来传导信号（Cell. 2003,113(6) :685-700)。在TGF-B配 体结合到适当的受体之后，接下来出现的信号就主要靠活化Smad复合物传递到细胞核。在 活化Smad复合物时，I型受体使由受体调节的Smad亚家族的成员磷酸化。磷酸化使这些 成员活化，一旦活化，这些成员就能与常见的中介体Smad(即Smad4)形成复合物。Smad 1、 Smad 5、Smad 8 是 ALK 1、ALK 2、ALK 3、ALK 6 的底物，Smad 2 和 Smad 3 是 ALK 4、ALK 5、 ALK 7的底物（FASEB J 13:2105-2124)。活化后的Smad复合物在细胞核中蓄积，直接参与 通常和其他特异性DNA结合转录因子相关联的靶基因转录。研究人员研制出了能选择性抑 制TGF-P受体的化合物，并已将它们用于治疗应用，另外，已在对各种干细胞群重新编程 且诱导其分化的背景下，使用了这些化合物来调控细胞命运。具体地，先前已使用ALK5抑 制剂来引导胚胎干细胞分化为内分泌细胞（Diabetes，2011，60(1) :239-47)。
[0018] 一般来讲，使祖细胞分化为功能性P细胞的过程涉及多个阶段。迄今为止人们已 认识到，要在体外定向引导人胚胎干细胞（"hES"）经历多阶段逐步形成与0细胞类似的 细胞颇为困难，另外，由人胚胎干细胞产生功能性0细胞也是相当繁琐的过程。在使祖细 胞分化的过程中，每个步骤面临的难题各不相同。虽然已在由祖细胞例如人多功能干细胞 产生胰腺细胞的方案方面取得进展，但仍需要继续开发用于产生功能性内分泌细胞（尤其 是功能性0细胞）的方案。
【附图说明】
[0019] 图1A至图1C绘出按实例1概述的步骤分化为胰腺内胚层/内分泌前体细胞的人 胚胎干细胞系H1的细胞中以下基因表达的实时PCR分析数据，这些基因分别是：PDX1 (图 1A)，NKX6. 1 (图 IB)，HB9 (图 1C)。
[0020] 图2A至图2C示出按实例1概述的步骤分化为胰腺内胚层/内分泌前体细胞的人 胚胎干细胞系H1的以下基因的FACS分析结果，这些基因分别是：PDX1 (图2A)，NKX6. 1 (图 2B)，HB9 (图 2C)。
[0021] 图3A和图3B示出在对细胞中的NXK6. 1、胰岛素或HB9行免疫染色后采集的细胞 图像。这些细胞首先按实例1概述的步骤分化为胰腺内胚层/内分泌前体细胞，再行免疫 染色。图3A的左图示出对NKX6. 1行免疫染色后的细胞图像，右图示出对胰岛素行免疫染 色后的细胞图像。图3B的左图示出对HB9行免疫染色后的细胞图像，右图示出对胰岛素行 免疫染色后的细胞图像。
[0022] 图4A、图4B和图4C绘出按实例2概述的步骤分化到第四阶段再到第六阶段的人 胚胎干细胞系H1，在分化过程的第四阶段第三天（图4A)、第五阶段第四天（图4B)和第六 阶段第三天（图4C)，其中roXl、NKX6. 1和HB9基因表达百分比的FACS数据。
[0023] 图5A为按实例2概述的步骤分化的细胞在分化第二阶段到第六阶段，其中的 HB9mRNA表达水平与人类胰岛中HB9mRNA表达水平的对比图。
[0024] 图5B绘出在对按实例2概述的步骤分化到第四阶段第三天的细胞行NXK6. 1和 HB9免疫染色后，采集的细胞图像：左图为对NXK6. 1行免疫染色后的图像，右图为对HB9行 免疫染色后的图像。
[0025] 图6A至图6J绘出按实例2概述的步骤分化到第四阶段，接着只在第四阶段、或 在第四阶段到第五阶段、或在第四阶段到第六阶段接受处理的人胚胎干细胞系H1的细 胞中以下基因表达的实时PCR分析数据。图6A至图6J依次绘出以下基因的表达数据： NKX6. 1 (图6A)，PDX1 (图6B)，NKX2. 2 (图6C)，胰高血糖素基因（图6D)，胰岛素基因（图 6E)，生长激素抑制素基因（图6F)，⑶X2(图6G)，白蛋白基因（图6H)，胃泌素基因（图61)， S0X2 (图 6J)。
[0026] 图7A示出对按实例2概述的步骤分化的对照培养物行免疫染色的结果，图7B示 出对按实例2概述的步骤分化的经处理培养物行免疫染色的结果。对第六阶段的对照培养 物和经处理培养物行免疫染色的结果显示，与第六阶段的对照组（图7A)相比，T3处理组 (图7B)中的HB9阳性细胞的数量显著增加。
[0027] 图8A和图8B绘出对按实例3概述的步骤分化到第六阶段的细胞，在分化过程第 六阶段第七天，行NKX6. 1和HB9免疫染色得到的结果。图8C绘出按实例3概述的步骤分 化到第六阶段的人胚胎干细胞系H1的细胞中HB9表达的实时PCR分析数据。
[0028] 图9A和图9B绘出按实例3概述的步骤分化到第六阶段的人胚胎干细胞系H1的 细胞，分别在分化过程第六阶段的第五天和第十五天，其中HB9的FACS数据。
[0029] 图10A至图10E绘出对根据实例4概述的方案分化的细胞，在分化过程第六阶段 第六天，行NKX6. 1和HB9免疫染色得到的结果。T3以剂量依赖的方式显著增加NKX6. 1阳 性胰腺内胚层前体细胞中HB9阳性细胞的数量。
[0030] 图11A至图11L绘出按实例4概述的步骤分化到第六阶段的人胚胎干细胞系H1 的细胞中以下基因表达的实时PCR分析数据，这些基因分别是：S0X2 (图11A)，NKX6. 1 (图 11B)，NKX2. 2(图 11C)，胃泌素基因（图 11D)，PDX1 (图 11E)，NGN3(图 11F)，PAX6(图 11G)， PAX4(图11H)，胰岛素基因（图111)，胰高血糖素基因（图11J)，生长激素释放肽基因（图 11K)，生长激素抑制素基因（图11L)。
【具体实施方式】
[0031] 结合附图阅读本发明的以下【具体实施方式】，能更好地理解【具体实施方式】。提供附 图是出于举例说明本发明的某些实施例的目的。然而，本发明并不限于示出的精确布置方 式、实例和手段。为了清晰说明本公开内容，以非限制性方式将本发明的【具体实施方式】分成 描述或阐明本发明的某些特征、实施例或应用方式的多个小节。
[0032] 本发明涉及使用某些甲状腺激素或其类似物、与ALK5(TGFP I型受体激酶）抑制 剂，以特定培养顺序产生对于NKX6. 1、H)X1和HB9呈阳性的胰腺内胚层细胞。因此，本发明 提供了一种体外细胞培养物，其用于使衍生自多能干细胞的细胞分化成表达0细胞谱系 的特征性标志物并表达NKX6. 1、H)X1和HB9的细胞。本发明还提供了利用体外细胞培养物 获得此类细胞的方法。在某些实施例中，本发明基于这样的发现：分化细胞中包含的T3、T4 或它们的类似物在细胞分化中充当HB9蛋白质表达的诱导物，以有利于向0细胞分化。HB9 在第三阶段和第四阶段都不以蛋白质水平表达。因此，本发明提供了通过调控HB9蛋白质 表达使干细胞分化的方法。具体地，本发明提供了通过使用T3、T4或它们的类似物与ALK5 抑制剂，以特定培养顺序产生对于NKX6. 1、H)X1和HB9呈阳性的胰腺内胚层细胞的方法。
[0033] 定义
[0034] 干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。 干细胞可产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特 征还在于其具备在体外分化成来自多个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的多种细胞谱系 的功能细胞的能力。干细胞还在移植后产生多种胚层的组织，并且在注射到胚泡内之后，促 成基本上至大部分（如果不是所有的话）组织。
[0035] 干细胞根据其发育潜能分类。多能干细胞能够产生所有胚胎细胞类型。
[0036] 分化是未特化的（"未定向的"）或特化不足的细胞获得特化细胞（例如神经细 胞或肌肉细胞）的特征的过程。分化的细胞是已在细胞谱系中占据更特化的（"定向的"） 位置的细胞。当应用于分化过程时，术语"定向的"是指已经在分化途径中进行到一定程度 的细胞，其中在正常情况下，该细胞将继续分化成特定的细胞类型或一个亚群的细胞类型， 并且在正常情况下，不能分化成不同的细胞类型或回复至分化程度更低的细胞类型。"去分 化"指细胞回复到细胞的谱系当中特化（或定向）程度较低的地位的过程。如本文所用， "细胞谱系"限定细胞的遗传性，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞 定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标记物是指与所关注谱系的细胞的表型明确 地相关联的特征，可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
[0037] 如本文所用，"标志物"是在所关注的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该语 境中，差异表达意指与未分化细胞相比针对阳性标志物的升高的水平以及针对阴性标志物 的下降的水平。由于标志物核酸或多肽在所关注细胞中的可检测水平充分地高于或低于在 其他细胞中的那些，所以可使用本领域已知的多种方法中的任何一种将所关注细胞与其他 细胞鉴别和区分开来。
[0038] 如本文所用，当在细胞中充分检测到特定标记物时，细胞"对于该特定标记物是阳 性的"，或是"阳性的"。相似地，当未在细胞中充分检测到特定标志物时，细胞为该特定标记 物"阴性"，或为该特定标记物"阴性"。具体地，FACS检测的阳性阈值通常大于2%，而FACS 检测的阴性阈值通常小于1%。通常以循环数（Ct)小于34判断PCR检测为阳性，而通常以 循环数大于34. 5判断PCR检测为阴性。
[0039] 尝试着在静态体外细胞培养物中将多能干细胞的分化过程复制进功能性胰腺内 分泌细胞时，通常将该分化过程视为分多个连续阶段循序进行。具体地，该分化过程常被视 为分六个阶段循序进行。在这种分步进行的过程中，"第一阶段"是指分化过程的第一步， 多能干细胞分化为表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞（下文也称作"第一阶段细 胞。"第二阶段"是指分化过程的第二步，表达定形内胚层细胞的特征性标志物的细胞分 化为表达肠管细胞的特征性标志物的细胞（下文也称作"第二阶段细胞"）。"第三阶段"是 指分化过程的第三步，表达肠管细胞的特征性标志物的细胞分化为表达前肠内胚层细胞的 特征性标志物的细胞（下文也称作"第三阶段细胞"）。"第四阶段"是指分化过程的第三 步，表达前肠内胚层细胞的特征性标志物的细胞分化为表达胰腺前肠前体细胞的特征性标 志物的细胞（下文也称作"第四阶段细胞"）。"第五阶段"是指分化过程的第五步，表达胰 腺前肠前体细胞的特征性标志物的细胞分化为表达胰腺内胚层细胞和/或胰腺内分泌前 体细胞的特征性标志物的细胞（下文统称为"胰腺内胚层/内分泌前体细胞"，或是"第五 阶段细胞"）。"第六阶段"是指分化过程的第六步，表达胰腺内胚层/内分泌前体细胞的特 征性标志物的细胞分化为表达胰腺内分泌细胞的特征性标志物的细胞（下文也称作"第六 阶段细胞"）。
[0040] 然而，应当指出在特定细胞群中并非所