样冷冻的 细胞可以用于生产生物物质，包括治疗相关蛋白。这些生物物质可以包括但不限于：病毒 (参见例如W0200138362)，结合性多肽如抗体，例如单克隆抗体及其片段，例如fab片段；Fc 融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白支架、酶、生长因子、激素、干扰 素、白介素和溶栓剂。这些生物物质可以使用任何本领域可用的方法收获。在一个实施方 案中，本发明提供产生生物物质的方法，所述方法包括：在适合于生产生物物质的条件下培 养能够表达生物物质的细胞，其中所述细胞获得自使用灌注培养和非离心浓缩方法产生的 高密度冷冻细胞库。所述生物物质可以是（但不限于）蛋白质（例如任何治疗相关蛋白）。 实施例
[0150] 通过以下实施例进一步阐述本发明，不应将这些实施例理解为进一步的限定。附 图的内容和本申请通篇引用的全部参考文献、专利和公开的专利申请通过提述以其整体明 确并入本文。
[0151] 实施例1:高密度细胞存储方案的设计和实施
[0152] 这种高密度细胞冷冻存储方案以2mL主细胞库瓶装细胞（工作体积I. 5mL)以 2. 0-2. 4xKT7个活细胞/mL的大约密度（正常细胞冷冻保持条件）开始。然后使细胞在 灌注培养中生长，并经由交替切向流浓缩。在将DMOS添加至浓缩的细胞培养物之后，将这 种高密度细胞培养物分配至大约200个单独的5mL小瓶（约4. 5mL工作体积）用于作为高 密度细胞库储存（大约l〇xl(T7个细胞/mL)。
[0153]实施例2 :测定用于支持快速细胞生长的最佳细胞保留方法和浓缩速度
[0154]为了测定用于创建高密度细胞培养物存储系统（图1)的最佳细胞保留方法，对标 准GE灌注生物反应器中的内置式浮动过滤器、TFF(切向流过滤）、ATF2和ATF4评估了它 们在限定参数下支持增加的细胞生长和活细胞密度的能力（表1)。
[0155] 表1:用于比较细胞保留方法的实验参数
[0156]
[0157]ATF4交替切向流系统支持了使用这些参数实现的较快的细胞生长以及快速的 (30分钟）最终4倍培养物浓度，而没有过滤器结垢。检验的其他方法产生了较低的活细胞 AiL浓度，证明了较低的浓缩效率，和/或在培养和/或浓缩过程中导致了结垢。这些结果 可见于图2、图11和表2。
[0158] 表2 :来自对不同细胞保留方法的比较的结果
[0159]
[0160] 实施例3 :测定收获用于浓缩和高密度存储的培养细胞的最佳时间
[0161] 为了测定最佳细胞收获时机以供后续的最终浓缩和高密度细胞冷冻存储，使rCHO 细胞系1的培养物在定制l〇_L贾AVE?(GEHealthcareLifeSciences)细胞袋式生物 反应器中在使用了交替切向流系统的灌注培养条件下生长。在灌注培养期间的多个时间点 收集不同细胞密度（14X106、33X106、56X106/mL)的细胞以制备小型库（图1)。
[0162] 通过在生长速率、活力和细胞死亡（凋亡）方面比较细胞解冻后的质量来评估这 些库。这些细胞在初始培养期间进行培养的参数和存储后评估中的参数示于表3。
[0163] 表3:用于测定最佳细胞收获时机的实验参数
[0164]
[0165] 以不同细胞密度从这些培养物制备的小型库的解冻后细胞性能在它们的细胞生 长速率、活力（图3)和凋亡速率（图4)方面相当。这些数据表明细胞健康且准备好可供 以高达约60xKT6个细胞/mL收获。
[0166] 选择了大约（30_40)x10~6个细胞/mL的收获密度以缩短培养时间段并使该过程 更切实可行。然后将这些培养物在30分钟内使用交替切向流系统进一步浓缩至>llxKT7 个细胞/mL。
[0167] 实施例4 :确定高密度细胞培养期间的最佳MMEi)参数
[0168] 为了使这种高密度细胞培养和存储方法更鲁棒（robust)并且使GMP可行，研究并 限定了WAVE?操作参数以建立这样的系统，在该系统中这种培养能够在缺乏自动pH和 DO控制的条件下得到保持。
[0169] 在使用表4中所见参数限定的与交替切向流系统组合的灌注培养系统中测试了 这些 1WAVE?操作参数。
[0170] 表4 :用于确定WAVE?操作参数的实验参数
[0171]
[0172] 氧传质（oxygenmasstransfer) (kLa)研究显示$後\^:_摇动速率和角度是影响 氧气传递的关键参数。另外，氧气和二氧化碳二者的顶部空间浓度能够显著影响DO和pH。
[0173] 应用与高灌注速率组合的包括1WAVE?摇动和通气（gassing)调节（表5)的简 化生物反应器操作条件以在没有自动控制的条件下实现目标DO和pH水平。
[0174] 表5 :没有pH和DO控制的生长期间的1WAVE?操作参数
[0177]当通过BloodGasAnayzer(BGA)测量的离线pH彡6. 9时，将C02设定点从10% 降低至5%。如果测量的离线pH再次<6.9,将C02设定点从5%降低至0%。如果离线pH 仍然彡6. 9,那么增加灌注速率。当测量的DO彡45%，将02设定点从20%增加至30%。如 果测量的DO再次彡45%，将摇动速度增加至25rpm并将摇动角度改变为12°。另外，将02 水平从30 %升高至40%。
[0178] 通过调节最终浓缩步骤期间的摇动速率（表6)进一步完善这种方法以避免将空 气纳入ATF4系统中。
[0179] 表6?浓缩期间的1WAVE?操作参数
[0180] 包括^WAVE?摇动和通气调节的一组简化的生物反应器操作条件产生了可比较 的细胞生长表现而不依赖于自动化pH和DO反馈控制，图5和6。摇动调节还在ATF4浓缩 步骤期间导致了最少的空气纳入。
[0181] 实施例5 :测定ATF浓缩步骤和DMOS暴露对于细胞健康的作用
[0182] 为了测定ATF4浓缩步骤和冷冻前DMSO暴露对细胞质量的作用，将摇瓶用在高密 度细胞存储流程中的不同阶段收集的活细胞接种以供生长评估。在表7中显示的条件下收 集和检验的样品为：浓缩前，浓缩后，和0-120分钟长度的DMSO暴露。
[0183] 表7:用于确定琢AVE?操作参数的实验参数
[0186] 浓缩前细胞和浓缩后细胞的细胞生长（图7A)和凋亡率（图7B)是可比较的，以 不同时长暴露于DMSO的细胞的细胞生长和凋亡率也是如此。这表明容器内30分钟ATF4 浓缩并在90分钟内完整规模分配超过200个小瓶并同时保持冷冻前的细胞质量是可行的。
[0187] 实施例6:测定存储后细胞质量和所述平台用于多种细胞系的适用性
[0188] 为了测定高密度细胞库的存储后细胞质量，培养并检测了解冻后细胞以确定它们 相对细胞生长速率、活力和凋亡水平。另外，采用了三种不同的细胞系（rCHO细胞系1、2和 3)从而确保这种平台能够便利地应用于其他细胞系。这些细胞在存储前和存储后所生长的 实验条件详细记载于表8。
[0189] 表8:用于多种细胞系的HD库的存储后细胞质量的实验参数
[0192]在高密度（IOx10~7个细胞/mL)和正常密度（2. 0-2. 4x10~6个活细胞/mL)存 储样品中评估了rCHO细胞系1 (图8A-B)、rCHO细胞系2 (图9A-B)和rCHO细胞系3 (图 10A-B)解冻后的细胞生长、活力和凋亡的水平。所述细胞显示了良好的生长速率和活力，以 及低水平的凋亡。回收率取决于所检测的细胞系而变化。
【主权项】
1. 一种用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方法包括： a) 在灌注生物反应器中培养细胞，其中搅拌所述生物反应器以进行有效的混合和气体 交换，其中将所述生物反应器偶联至细胞保留系统； b) 以非离心的方式浓缩所述细胞以产生浓缩的细胞群体； c) 冷冻保存浓缩的细胞群体以产生高密度冷冻细胞库。2. 权利要求1的方法，其中所述细胞保留系统包含交替切向流过滤系统，所述交替切 向流过滤系统包含过滤器。3. 权利要求2的方法，其中所述过滤器具有至少0. 3m2,优选约0. 3m2至约0. 5m2,约 0. 5m2至约 1.0 m2,约 0. 7m2至约 0. 8m2,约 1.0 m2至约 2. Om2,约 2. Om2至约 3. Om2,约 3. Om2至 约4. Om2,或约4. Om2至约5. Om 2的表面积。4. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述过滤器具有选自0. 2 y m、0. 4 y m和 0. 65ym的孔径。5. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述浓缩的细胞群体具有选自LOx KT8个细 胞/mL、l. Ix 1(T8 个细胞/mL、1.2x 1(T8 个细胞/mL、1.3x 1(T8 个细胞/mL、1.5x 1(T8 个 细胞/mL、I. 7x KT8个细胞/mL和2. Ox KT8个细胞/mL的细胞密度。6. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述冷冻保存包括以约5%至约10%体积/体 积的终浓度将DMSO添加至浓缩的细胞群体。7. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述冷冻保存包括将至少一部分浓缩的细胞群 体冷冻在适合于在冷冻保存条件下储存的容器中。8. 权利要求7的方法，其中所述容器是小瓶。9. 权利要求7的方法，其中所述容器是冷冻袋。10. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述高密度冷冻细胞库具有约lx KT8个细 胞/mL的细胞密度。11. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述灌注生物反应器中的灌注速率为约 0. 2nL/细胞/天至约0. 5nL/细胞/天。12. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述灌注生物反应器细胞培养物具有约6. 8 至约7. 2的pH。13. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述灌注生物反应器细胞培养物具有至少约 30 %的溶解氧浓度。14. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物反应器是柔性袋式生物反应器。15. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述高密度冷冻细胞库具有选自至少60%、 至少约90 %和至少约95 %的解冻后活力。16. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。17. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是经转染的细胞。18. -种用于产生高密度冷冻细胞库的非离心方法，所述方法包括： a) 在灌注生物反应器中培养细胞，所述灌注生物反应器偶联至交替切向流过滤系统， 其中所述生物反应器包含柔性袋式生物反应器，并且其中所述过滤器具有至少0. 3m2的过 滤器表面积，和具有至少50kDa的MffCO尺寸的过滤器； b) 使用交替切向流过滤系统以非离心的方式浓缩所述细胞，以产生具有大于约Ix 10~8个细胞/mL的密度的浓缩的细胞群体； c)冷冻保存所述浓缩的细胞群体以产生高密度冷冻细胞库，其中所述冷冻保存包括以 约5%至约10%体积/体积的终浓度将DMSO添加至浓缩的细胞群体；并且其中所述高密度 冷冻细胞库具有约lx KT8个细胞的细胞密度。19. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养物的pH和DO通过自动化方法控制。20. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养物的pH和DO通过非自动化方法控 制。
【专利摘要】本公开提供一种使用灌注培养技术和细胞的非离心浓缩来创建高密度冷冻保存细胞库的方法。还提供使用这种高密度冷冻保存的细胞库的生产方法。
【IPC分类】C12M1/00, C12M1/34, C12M3/06
【公开号】CN105102605
【申请号】CN201480015761
【发明人】X·金, H·董, C·布瑟
【申请人】建新公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2906600A1, US20140273206, WO2014143691A1