单细胞中的靶蛋白和靶核酸的同时检测的制作方法
【专利说明】单细胞中的靶蛋白和靶核酸的同时检测
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/799,559的权益，该临时 申请为了所有目的通过引用并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及对于在单细胞中检测核酸，例如RNA是足够灵敏的基于扩增的检测系 统。该方法可与用于蛋白检测的邻近延伸测定（proximity extension assay)组合使用以 提供检测核酸和蛋白两者的多重测定。
[0004] 背景
[0005] 由单独的细胞检测和定量蛋白和核酸是令人期望的，但因为单细胞中存在的材料 微量而难以实现。此外，不像大块样品（bulk sample)，单细胞不可划分为部分以分别分析 蛋白和核酸水平。尽管单分子检测技术或质谱可提供用于实现单细胞分析的方法，这些方 法是昂贵的。最近，已开发了一种测定，邻近延伸测定（PEA)，其足够灵敏以检测皮克量的蛋 白（参见，例如，Lundberg 等人，Nucl. Acids Res. 2011 Aug ;39 (15): el02;epub 2011 Jun 6,通过引用并入本文）。在一种方法中，PEA采用各具有附着至它的寡核苷酸的一对抗体。 寡核苷酸包含彼此互补的区域。当抗体结合至靶蛋白时，寡核苷酸足够紧密邻近，使得来自 各寡核苷酸的互补区域彼此杂交。DNA聚合酶的添加导致杂交的寡核苷酸的延伸。然后可 检测或定量延伸产物。
[0006] 发明简述
[0007] 在各个方面，本发明包括，但不限于，以下的实施方案。
[0008] 在一个方面，本发明提供了在样品中检测靶核酸，通常为RNA，的方法，该方法包括 (a)在反应混合物中孵育：i)包含靶核酸的样品；和ii)包含第一和第二探针的一对邻近 探针，其中：第一探针包含与靶核酸的第一靶（T)区段杂交的靶结合（TB)区段，和在该探针 的3'末端处的相互作用（I)区段，其中I区段与在第二探针的3'末端处的I区段互补；且 第二探针包含与紧密邻近（in close proximity)该第一 T区段的革E核酸的第二、非重叠T 区段杂交的TB区段，和在3'末端处的I区段，其中该3'序列与该第一探针的I区段互补， 其中
[0009] 将反应混合物在其中第一探针的TB区段与靶核酸的第一 T区段杂交且第二探针 的TB区段与靶核酸的第二T区段杂交的条件下孵育，由此允许第一探针的I区段与第二探 针的I区段杂交以形成包含第一和第二探针的I区段的双链体；
[0010] (b)添加DNA聚合酶并在其中延伸第一和/或第二探针的条件下保持反应混合物 以获得第一延伸产物；
[0011] (c)在包含扩增第一延伸产物、或其亚区的一对扩增引物的扩增反应混合物中扩 增延伸产物、或其亚区；
[0012] (d)检测（C)中获得的扩增子。
[0013] 在一些实施方案中，检测扩增子的步骤包括使用例如qPCR反应定量扩增子。
[0014] 在一些实施方案中，样品是单细胞。
[0015] 在一些实施方案中，邻近对的成员中的一个在3'末端被封闭，以在步骤（b)中延 伸仅一个探针。
[0016] 在一些实施方案中，在延伸步骤中应用的DNA聚合酶具有3'核酸外切酶活性。在 一些实施方案中，用于扩增步骤的聚合酶与用于延伸步骤的聚合酶不同。例如，用于扩增步 骤的聚合酶可以是热稳定的，而用于延伸步骤聚的合酶可不是热稳定的。
[0017] 在一些实施方案中，该方法还包括检测样品中的靶蛋白。在这样的实施方案中，该 方法还包括：
[0018] 将（a)的反应混合物中的样品与包含第一和第二蛋白检测邻近探针 (protein-detecting proximity probes)的一对蛋白检测邻近探针孵育，其中：
[0019] 第一蛋白检测探针包含与靶蛋白结合的第一抗体，所述第一抗体与第一多核苷酸 连接，所述第一多核苷酸包含与第二探针的3'末端上的I区段互补的3'末端上的I区段； 且
[0020] 第二蛋白检测探针包含与靶蛋白结合的第二抗体，所述第二抗体与第二多核苷酸 连接，所述第二多核苷酸包含与第一多核苷酸的3'末端上的I区段互补的I区段；
[0021] 其中第一抗体与靶蛋白的结合和第二抗体与靶蛋白的结合允许第一蛋白邻近探 针的I区段与第二蛋白邻近探针的I区段杂交以形成步骤（b)中延伸的双链体，以提供第 二延伸产物；
[0022] 使用扩增第二延伸产物或其亚区的一组引物在（c)的扩增反应中扩增第二延伸 产物、或其亚区；以及
[0023] 检测来自第二延伸产物或其亚区的扩增的扩增子的量。
[0024] 在一些实施方案中，检测该量的步骤包括使用例如qPCR反应定量扩增子的量。
[0025] 在一些实施方案中，反应是在其中检测多种RNA的多重反应。
[0026] 在另外的方面，本发明包括邻近探针对用于检测/定量样品中的靶核酸的用途； 或邻近探针对用于检测/定量样品中的靶核酸和蛋白的用途。在一些实施方案中，本发明 提供了邻近探针对用于检测/定量样品中的靶核酸的用途；或邻近探针对用于检测/定量 样品中的靶核酸和蛋白的用途，其中邻近探针对的成员的一个被封闭。
[0027] 附图简述
[0028] 图1示出了检测靶RNA的核酸邻近延伸测定的一个实施方案。在该实施方案中， 探针对的各成员的3'末端是可延伸的。
[0029] 图2示出了检测靶RNA的核酸邻近延伸测定的另一个实施方案。在该实施方案中， 探针中的一个的3'末端被封闭。
[0030] 详细说明
[0031] 1.宙2和术语
[0032] 如本文所用，"序列"意指多核苷酸的核酸碱基序列。除非另外指明或从上下文明 显，当碱基或序列元件在多核苷酸中出现时，它们以顺序5'至3'呈现。
[0033] "多核苷酸"或"核酸"包括RNA或DNA的任何形式，包括例如，基因组DNA ;互补 DNA (cDNA)，其是信使RNA (mRNA)的DNA表示，通常通过mRNA的逆转录获得；以及合成或通 过扩增产生的DNA分子。多核苷酸可包括包含非标准碱基（例如，肌苷）的嵌合分子和核 酸。多核苷酸可以是单链或双链的。
[0034] 术语"寡核苷酸"在本文中用于指是相对短的，通常短于200个核苷酸，更特别地， 短于100个核苷酸或短于50个核苷酸的核酸。通常，寡核苷酸是单链DNA分子。
[0035] "靶多核苷酸"或"靶核酸"是包含靶序列的多核苷酸。在双链靶多核苷酸中，靶序 列在一条链上且靶序列的互补序列（complement)在另一条链上。"靶RNA"是包含靶序列 的 RNA0
[0036] 术语"区段"是指多核苷酸中的序列或亚序列，诸如具有特定功能的区段，例如，探 针结合区段、引物结合区段、索引序列，本文还称为"标签序列"以及本文所列出的其他区 段。单独的区段可具有与它们的预期功能一致的任何长度，诸如，但不限于，在10-100个核 苷酸、10-70个核苷酸、14-50个核苷酸、14-35个核苷酸的范围内的长度。
[0037] "靶序列"是在测定中检测的核酸序列。在大多数情况下，感兴趣的靶序列是预定 义的（即，分析之前序列已知）。在其他情况下，完整的靶序列是未知的，而是被定义为由 已知序列的引物扩增的序列。靶序列可在DNA(包括基因组的、线粒体的、病毒的、合成的和 cDNA)，在RNA、或其可扩增的合成类似物中发现。
[0038] 如本文所用，术语"互补"是指两个核苷酸之间精确配对的能力。即，如果核酸的 给定位置上的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键键合，则这两个核酸被认为在该位置 上彼此互补。"互补序列"可以是完全互补或部分互补的序列。两个单链核酸分子之间的互 补性可以是"部分的"，其中仅一些核苷酸结合，或当在单链分子之间存在总互补性（total complementarity)时，它可以是完整的。当存在足够互补性使得序列在测定条件下杂交 (形成双链区域）时，认为两种寡核苷酸具有"互补"序列。核酸链之间的互补性程度对核 酸链之间杂交的效力和强度具有显著效应。部分互补的两条序列可具有，例如，在至少7个 核苷酸的序列上，更通常在10-30个核苷酸的序列上，通常在14-25个核苷酸的序列上，且 有时在更长序列（例如，26-100个核苷酸长度）上的至少90%同一性、或至少95%、96%、 97%、98%、或99%同一性序列。将理解，引物序列的3'碱基将可期望与靶核酸序列的相 应碱基完全互补以允许引发发生。当由第一序列组成的多核苷酸与由第二序列组成的多核 苷酸足够互补以特异性杂交时，第一序列或区段与第二序列或区段"基本上互补"。为了便 于说明，杂交条件是小于约1.0 M钠离子，通常约0.0 lM至1.0 M钠离子的盐浓度，在pH 7. 0 至8. 3,和用于10个至50个核苷酸长度的多核苷酸的至少约30°C及用于更长探针（例 如，大于50个核苷酸）的至少约60°C的温度。通常，当在至少14个-25个核苷酸的延伸 (stretch)上存在至少约55%碱基互补、优选地至少65%、更优选地至少75%、更优选地至 少85%、更优选地至少90%、和最优选地至少95%时，特异性杂交将发生。引号[']用于 指不完全或基本互补序列。
[0039] 提及两条多核苷酸序列、区段或链的术语"退火"、"杂交"或"结合"，可互换使用， 并具有本领域的通常含义。两条互补序列（例如，DNA和/或RNA)通过与互补碱基形成氢 键来退火或杂交，以产生双链多核苷酸或多核苷酸的双链区域。
[0040] 如果不存在隔开多核苷酸中的两个序列或区段的插入序列或非核苷酸连接体，则 它们是"相邻的（adjacent)"或"邻近的（contiguous)"。在一些情况下，"不相邻"是指两 条探针结合序列通过插入靶序列彼此分离。
[0041] "引物"是包含与靶序列、或其互补序列互补，并能够杂交的序列的寡核苷酸或多 核苷酸。通常，"引物"意指可引发模板依赖