积由RNA浓度来确定，本实验中为X= 500钢克/RNA浓 度。前述反转录试剂盒购自大连宝生物有限公司（Takara)。
[0028] (2)QPCR定量检测 WcDNA稀释液为实时定量PCR模板，引物终浓度为200nM，反应总体积为10y1。实 时定量PCR仪器使用ABI7900HTsequenceDetectionSystem,用384孔板完成。每个样 本重复二到=次。在溶解曲线基本符合要求无非特异性扩增的情况下，参考操作手册，采用 t虹esholdcycle(Ct)方法获得相对表达量，WP-ACTIN为内参。具体程序参看表2。
[0029]表 2
[0030] (3)采用ArrayTools4. 1.0进行数据分析 用前述方法可测得样品中目标IncRNA和参照IncRNA的Ct值水平求得目标IncRNA在 组织中的相对含量。用0-ACTIN为参照矫正IncRNA的量，通过QPCR检测中经典的2AU 的方法表示组织样本中IncRNA的水平（-ACt为目标IncRNA与对照的Ct值之差)。
[0031] 3、组织样本中ACO16745. 3水平诊断前列腺癌 如图1，与正常对照组织样本中AC016745. 3的高含量相比，前列腺癌患者组织样本中 的AC016745. 3含量相对较高，且普遍高于正常组织样本的平均值，正常样本平均值约为肿 瘤样本的平均值的5倍，差异有统计学意义。
[0032] 实施例2:前列腺癌细胞系中AC016745. 3-siRNA对AC016745. 3沉默效率检测 本实施例中使用的前列腺癌分子祀标AC016745. 3的SiRNA序列为： AC016745. 3siRNA正义链序列：5 '-GCGUCUAAGAGAGUACUUU-3 '(沈QIDNO. 6)AC016745. 3siRNA反义链序列：5 '-AAAGUACUCUCUUAGACGC-3 '(沈QIDNO. 7) 使用的阴性对照（NC)的SiRNA序列为： NCSiRNA正义链序列：5 '-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 '(沈QIDNO. 8) NCSiRNA反义链序列：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3 '(沈QIDNO. 9)。
[0033] 本实施例主要步骤如下： 1、细胞的SiRNA转染六孔板为例） 将前列腺癌PC-3细胞系接种到六孔板中，使得次日的细胞汇合度约40-50%，将5yL的Lipofectamine2000 和 250yLOpti-MEM混合解育，同时将加 1 20uM/L的SiRNA与 250yL 化ti-MEM混合解育。静置5min后将两者混合。同时将细胞用PBS洗一遍，换成1. 5ml的 化ti-MEM。转染混合物静置20min后，均匀滴加到六孔板中，SiRNA的终浓度为50uM/ml。 4-6小时后更换成完全培养基继续培养。
[0034] 2、细胞中总RNA的提取 细胞转染并培养4化后，收集细胞并提取其总RNA，提取方法同实施例1。
[0035] 3、定量检测细胞中的IncRNA并进行数据分析 定量检测及数据分析方法同同实施例1。
[0036] 4、AC016745.3SiRNA对AC016745.3 沉默效率 如图2，在口(：-3转染4〇)16745.3 311?酷之后，4〇)16745.3的表达量下降了40%^上。 证明AC016745. 3SiRNA可W有效敲减AC016745. 3在前列腺癌PC-3细胞系中的表达。 [0037]实施例3:AC016745. 3-siRNA显著抑制前列腺癌细胞的增殖，可用于前列腺癌药 物的制备。 阳03引本实施例主要步骤如下： 1、细胞的SiRNA转染六孔板为例） 转染方法同实施例2。
[0039] 2、细胞增殖实验 细胞消化后重悬，接种于96孔中，并设置只加100yL1640培养基的对照孔。接种化、 24h、4化后，每孔分别加入IOulCKK-8试剂后，细胞培养箱中继续解育2小时。使用在酶标 仪检测波长450nm处各孔的光吸收值（0D)，参比波长630nm化00-650nm)。W各孔光吸收值 减去空白孔光吸收值的平均值作为实际光吸收值，取平均值，W化、24h、4化时间点光吸收 值作曲线，反映细胞的增殖情况。 W40] 3、AC016745. 3-siRNA影响前列腺癌细胞的增殖情况 如图3, AC016745. 3-siRNA显著抑制前列腺癌细胞的增殖，可用于前列腺癌药物的制 备。
[0041] 实施例4:药物SB20580能显著抑制前列腺癌细胞系中AC016745. 3的表达，可作 为潜在前列腺癌的药物。
[0042] 本实施例主要步骤如下： 1、细胞的处理 将前列腺癌PC-3细胞系接种到六孔板中，使得次日的细胞汇合度约70%，第二天将正 常的培养基更换为含有浓度为10yM的培养基，分别培养0小时，2小时，4小时。
[0043] 2、细胞中总RNA的提取 收集细胞并提取其总RNA，提取方法同实施例1。 W44] 3、定量检测细胞中的IncRNA并进行数据分析 定量检测及数据分析方法同同实施例1。
[0045] 4、药物SB20580对AC016745. 3的抑制率 如图4,在使用药物SB20580对细胞处理之后，ACO16745. 3的表达量在化和4h后分别 下降了15%和50% W上。证明药物SB20580可W有效抑制AC016745. 3在前列腺癌PC-3细 胞系中的表达，可作为潜在前列腺癌的药物。
[0046] 实施例5:本前列腺癌的诊断试剂盒的应用 本实施例主要步骤如下： 1、组织样本、血液、尿液中总RNA的提取 按照每50mg组织或200ul血液或200ul尿液使用1血的Trizol试剂的量处理组织样 本、血液、尿液，吹打均匀后转移到无RNA酶的1. 5ml化管中；向匀浆中加入1/5体积的氯 仿，振荡离屯、管至溶液乳化成乳白状，无分相，12000巧m4°C离屯、15min;吸取上清至新 管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，-20。C化沉淀；12000巧m4°C离屯、IOmin;弃上清， 沿管壁轻轻加入Iml75%乙醇，轻洗EP管，12000巧m4°C离屯、2min;弃上清，短暂离屯、， 用枪吸去剩余上清，置于通风楓内惊干；加入适量DEPC水，用枪吹打使沉淀溶解；定量：电 泳检测抽提质量，紫外分光光度计检测0D260/0D280和样品浓度；得到组织样本、血液、尿 液中总RNA，放置-80 °C保存。
[0047] 2、检测组织样本、血液、尿液中的AC016745. 3相对前列腺正常组织表达量变化 使用试剂盒中试剂，按照实施例1中反应体系与条件，使用试剂盒中前列腺正常组织 CDNA作为QPCR定量检测中的对照cDNA，检测组织样本、血液、尿液中的AC016745. 3相对前 列腺正常组织表达量变化，分析检测结果，样本和对照间比较采用t检验，P<0. 05为差异显 著，判为检测样本阳性。
[0048] 本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的 原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，运些变化和改 进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物 界定。
【主权项】
1. 一种前列腺癌分子靶标，其特征在于为AC016745. 3,是一种IncRNA，其核苷酸序列 为 SEQ ID NO. 1 所示。2. 如权利要求1所述的前列腺癌分子靶标在筛选预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药 物中的应用。3. -种如权利要求1所述的前列腺癌分子靶标的抑制剂。4. 如权利要求3所述的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述抑制剂制备的药物包括AC016745. 3 的 SiRNA06. -种前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于含有前列腺癌分子靶标AC016745. 3， AC016745. 3是一种IncRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。7. 根据权利要求6所述的前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于包括： (1) 组织样本、血液和尿液中总RNA提取试剂； (2) 反转录试剂； (3) 定量PCR试剂； 引物为AC016745. 3和对照P -ACTIN两对引物； 对照P-ACTIN的引物序列如下： 0-ACTIN上游引物序列：SEQ ID NO. 2 0 -ACTIN下游引物序列：SEQ ID NO. 3 ; 检测AC016745. 3的引物序列如下： AC016745. 3 上游引物序列：SEQ ID NO. 4 AC016745. 3 下游引物序列：SEQ ID NO. 5。8. 如权利要求1所述的前列腺癌分子靶标作为标志物在制备前列腺癌高危人群筛选、 诊断、药物设计、治疗及状况监测、预后监测的试剂盒中及药物中的应用，其特征在于：通过 检测被试者血清、尿液和组织样本中AC016745. 3的含量，并与正常水平AC016745. 3含量相 比较，以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗及状况监测、预后监测。9. 如权利要求1所述的前列腺癌分子靶标作为标志物在制备前列腺癌高危人群筛选、 诊断、药物设计、治疗及状况监测、预后监测的试剂盒中及药物中的应用，其特征在于：所述 被试者血清、尿液和组织样本中AC016745. 3的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行 检测。10. -种用于检测前列腺癌分子靶标AC016745. 3的引物序列： 上游引物序列：5 ' -GGTGACGAAAATTCTACAITGCT-3 ' 上游引物序列：5 ' - ACCTGGCTGGTGTCCTCTG -3 '。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体为AC016745.3作为一种前列腺癌分子靶标及其在诊断试剂盒中的应用。AC016745.3是一种lncRNA，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1所示。本发明包括该前列腺癌分子靶标在筛选预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的应用；包括该前列腺癌分子靶标的抑制剂，以及该抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的应用；包括含有前列腺癌分子靶标的前列腺癌诊断试剂盒；还包括该前列腺癌分子靶标和诊断试剂盒在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用等。使用该分子靶标及含有该分子靶标的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有较高的特异性和灵敏度及易于大量筛查的特点。
【IPC分类】C12N15/113, A61P35/00, C12Q1/68, C12N15/11, A61K48/00
【公开号】CN105154447
【申请号】CN201510588895
【发明人】李瑶, 鲍升林, 黄文华, 万学超, 张亚龙, 吴海
【申请人】复旦大学, 上海济远生物科技有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月16日