用于制备和分析核酸的装置的制造方法
【专利说明】
[0001] 政府权益声明
[0002] 本文所述的工作由美国陆军医学研究购置活动化S.ArmyMedicalResearch AcquisitionActivity)拨款提供部分资金，合同号为W81XWH-10-2-0158。美国政府对本 发明享有一定的权利。
[000引背景
技术领域
[0004] 本发明一般地设及用于处理样品的微流体装置和方法，所述样品用于分子诊断应 用，例如祀核酸序列的检测。
[0005] 相关技术描述
[0006] 分子诊断在当今全球医疗环境中具有重要的作用。在发展中国家，95%的死亡 是由于缺乏对传染病，即急性呼吸道感染（ARIs)、追疾、HIV、和肺结核（TB)的正确诊断 W及相关的后续治疗（Yager，Petal，AnnuRevBiomedEng10:107-144,2008)。最 近的大流行病如2009H1N1甲型流感流行增加了对于有效检测和控制传染病的工具的需 要。在控制新型传染病的挑战中加入了如"快速病原体突变速度、非人病原体向人病原 体的转变、和非人病原体与人病原体的重组"的因素化iechle，FLetal.，ClinL油Med 29 (3) : 555-560, 2009)。日益增加的全球流动性帮助传染病从发源地区传播到世界的其它 地方，正如在2009化N1的大流行中所看到的。运种流动性彰显了将快速、便携式诊断（护 理点[P0C])装置作为预防传染病全球传播的初步手段的一部分的需要。目前的实验室病 原体培养方法需要一天或更长时间来提供结果。
[0007] 对于特定的其他类型的传染病，在发达国家和发展中国家中，需要定期地重复进 行诊断性测试，W测量对治疗的反应，并监测疾病状况。一个运样的例子是对于传染病如 HIV(人免疫缺陷病毒）和丙型肝炎，监测病毒载量（每毫升血液中病毒颗粒的数量）。南 撒哈拉非洲是AIDS流行严重感染地区。在运些地区，缺乏标准实验室设施和受过训练的实 验室技术人员是严重的障碍。在美国的医疗条件差的地区存在类似的问题。能够在人群中 分发使其易于获得，甚至是可W在家中获得的快速、低成本的诊断工具将会允许更快速地 诊断和监测疾病和感染，从而提供实质性的益处。
[0008] 核酸生物标志物是目标分析物，它用于几种对全球卫生有高度重要性的传染性疾 病，包括HIV、HCV、皿V、流行性感冒、和登革热。在开发简单诊断装置W测试多种病毒剂上 的主要挑战是：一些病毒的基因组由DNA组成，而其他病毒的基因组由RNA组成。基于RNA 的分析物的进一步的挑战是样品处理，所述样品处理要保护运些不稳定分子的完整性。有 几种市售产品对后者的问题提出了解决方案。运些产品大部分是昂贵的、技术难度大的、和 /或需要某种形式的冷藏。运些要求不容易被小型化的微流体装置满足，所述微流体装置具 有盒上试剂库（on-cartridgereagentreservoirs),所述盒上试剂库被设计用于快速、原 地的诊断性分析。而且，运些要求在资源匿乏或远程的情况下难W满足，正如大多数发展中 国家的情况。因此，需要有低成本的、无测量的（non-instrumented)、和操作简单的诊断装 置，可用于制备核酸的稳定样品，并在护理点（POC)分析DM和RNA两种生物标志物。
[0009] 血液是人体组织，常规用于核酸表达研究和基于血液的生物标志物分析，因为它 可W容易地收集。但是，全血通常含有许多成分，例如血红素和肝素，它们干扰和/或抑制 许多下游的分析步骤。而且，血浆的核酸酶（RNase)活性非常高，将运种活性减至最小对 于任何RNA分离程序来说都是重要的。虽然可在严格的条件下从临床样品制备DNA，并且， 例如，简单地将DNA点样在滤纸上并在室溫干燥来使其稳定，RNA的制备通常需要使用稳定 剂和冷藏和/或冷冻。稳定临床样品的RNA的步骤是繁琐的，不适用于微流体、"采样反馈 (sampletoanswer)"诊断装置。
[0010] 两种方法的变形形式曾被用于制备来自生物样品的RNA:化学提取和固定在玻璃 上，通常被称为"固相提取"。化学提取通常使用高度浓缩的离液盐和酸性酪或酪-氯仿溶 液来使RNases失活，并从其它生物分子中纯化RNA。运些方法提供了RNA的非常纯的制备 物；但是，通常必须用醇沉淀步骤对RNA进行脱盐和浓缩。固相提取方法，在Boometal的 美国专利No. 5, 234, 809中描述，依赖于离液试剂硫氯酸脈的裂解和核酸酶失活特性，W及 运种试剂存在时的固态二氧化娃颗粒或娃藻类的核酸结合性质。用含有乙醇的高盐缓冲液 洗涂与二氧化娃结合的RNA之后，在低离子强度的缓冲液中洗脱RNA。
[0011] 容易理解，需要使用有机溶剂或离液试剂进行水相提取的样品制备方法是冗长 的、危险的、劳动强度大的、和速度慢的。而且，如果在进行运些程序的时候没有特别小屯、， 可能发生核酸酶的残余污染，样本核酸会被降解或消失。用运种样品进行的诊断测试可能 由于运种降解而给出假阴性结果。假阴性结果还可W由于化学干扰造成，例如来自于残留 的阴离子去垢剂、离液盐、或样品中残余的并且会抑制祀序列扩增程序的乙醇。如果已经使 用了阴离子去垢剂和蛋白酶，残余的蛋白水解活性也可能降解祀序列扩增和/或杂交检测 反应中使用的酶，并产生假阴性结果。在'809专利中公开的基于"爆轰裂解度oomlysis)" 方案的样品制备方法通常被认为是充分应对了运些问题。但是，本发明人出人意料地发现， 运些提取方法，即使用离液盐结合固相提取，在制备用于皿V基因组的WPCR为基础的检测 的血液或血浆样品时，并不总是有效的。因此，上述的方案均不适于从复杂生物起始材料， 例如全血或血清中制备用于同时检测DNA和RNA祀序列的通用样品。运对于在临床实验室 条件下和在资源缺乏地区的传染病诊断来说的是千真万确的，在临床实验室条件下对时间 的要求非常高，在资源缺乏地区，成本效益、减少有毒废物流和简易性也很重要。
[0012] 虽然在该领域取得了进展，在护理点诊断装置领域仍然存在需要，例如微流体装 置，其能够从测试样品分离和分析核酸。本发明满足了运些需要并进一步提供了相关的益 处。
[001引发明简述
[0014] 本发明的实施方案针对上述的全球健康需要，提供微流体装置，所述微流体装置 用于对来自测试样品，例如血液产品的核酸进行制备、稳定、和分子分析。本发明人令人惊 讶地发现一种简单的样品制备方案产生含有DNA和/或RNA的样品，所述样品适合作为扩 增反应中的即用试剂，所述简单的样品制备方案的基础是用粘±矿物和碱性缓冲液进行处 理。不受理论的束缚，相信粘±矿物的作用是保护核酸不被酶降解（由于核酸酶活性）并 且不被水解降解（由于碱性提取试剂）。本发明装置制备的核酸样品基本不含核酸酶活性， 并且在用于修饰酶的时候是优选的底物。本发明的微流体装置的实施方案在同时检测人血 液的微量样品或其它测试样品的RNA和DM祀序列时特别具有益处。
[0015] 在相关的实施方案中，本发明提供改进的集成微流体装置，用于将核酸样品制备 与下游的分子分析集成化。该装置的实施方案尤其适用于同时分析通用测试样品中的DNA 和RNA。在特定的实施方案中，本发明装置的特征在于用于制备核酸的试剂被预先装载到该 装置中，所述核酸适合于立即扩增。运些试剂包括，但不限于，粘±矿物和碱性缓冲液。
[0016] 因此，本发明的实施方案提供用于制备和分析测试样品中的核酸的微流体装置， 其包括具有第一端部和第二端部的微流体通道；与微流体通道的第一端部流体连接的样品 进口；与所述微流体通道流体连接的粘±处理室，其中所述黏±处理室含有粘±矿物试剂； 与所述粘±处理室流体连接的样品裂解室，其中所述样品裂解室含有碱性溶液；一个或多 个样品核酸扩增和检测孔，其与所述样品裂解室流体连接；和一个或多个样品出口。在另 一个实施方案中，本发明提供用于制备和分析测试样品中的核酸的微流体装置，其中粘± 矿物选自高岭石、蒙脱石、或伊利石的组。在另一个实施方案中，本发明的粘±矿物是滑石、 埃洛石化allosite)、膨润±、合成粘±矿物、或裡皂石中的一种。在另一个实施方案中，本 发明提供用于制备和分析测试样品中的核酸的微流体装置，其中碱性溶液是K0H、化0H、或 LiOH。在另一个实施方案中，本发明提供用于制备和分析测试样品中的核酸的微流体装置， 其进一步包括在裂解室下游的中和室，其中含有酸性试剂。在其它的实施方案中，酸性溶液 是肥IX2H4O2、或H2SO4。在另一个实施方案中，本发明提供用于制备和分析测试样品中的核 酸的微流体装置，其中测试样品包含一种或多种感染原。在另一个实施方案中，感染原是病 毒原。在另一个实施方案中，感染原是至少两种病毒原。在另一个实施方案中，感染原是DNA 病毒和RNA病毒。在另一个实施方案中，感染源是皿V和HCV或HIV。在另一个实施方案 中，本发明提供用于制备和分析测试样品中的核酸的微流体装置，其中测试样品包括血液、 血浆、血清、尿液、唾液、疲液、呼吸系统灌洗液、泪液、或组织拭子。在另一个实施方案中，本 发明提供用于制备和分析测试样品中的核酸的微流体装置，其中该装置进一步包括载置累 (on-devicepump),其与微流体通道的第二端部流体连接。在另一个实施方案中，本发明 提供用于制备和分析测试样品中的核酸的微流体装置，其中该装置进一步包括设置在样品 进口和微流体通道的第一端部之间的复合膜，其中所述复合膜能够从血液中除去选定的颗 粒。在其它实施方案中，复合膜可W由激发血液凝固的材料组成。在另一个实施方案中，复 合膜可W由玻璃滤膜组成。
[0017] 还提供了使用微流体装置制备和分析含核酸样品的方法。例如，在一个实施方案 中，该方法包括：
[0018] a)将怀疑含有目标核酸的样品引入所公开的微流体装置的任何一个中；
[0019] b)使样品与所述微流体装置中的粘±矿物接触；W及
[0020] C)在所述微流体装置中裂解所述样品。
[0021] 在一些实施方案中，该方法进一步包括在所述微流体装置中扩增裂解的样品，W 获得扩增的样品，并可选地检测扩增样品中的目标核酸。
[0022] 还提供了微流体装置在分离目标核酸中的应用。在一些实施方案中，该应用进一 步包括扩增目标核酸和可选地检测目标核酸。
[0023] 附图简述
[0024] 图1是示意图，显示根据本发明的一些方面的微流体装置的第一实施方案。
[00巧]图2是示意图，显示根据本发明的一些方面的微流体装置的第二实施方案。
[0026] 图3是示意图，显示根据本发明的一些方面的微流体装置的第=实施方案的操 作。
[0027] 图4是示意图，显示根据本发明的一些方面的微流体装置的第四实施方案的操 作。
[0028] 图5A-B是剖视图，显示根据本发明的一些方面的复合膜的第一和第二实施方案 的操作。
[0029]图6是可W在本发明的装置中进行的过程的实例的逐步说明。
[0030] 发明详述
[0031] 本发明人令人惊讶地发现，粘±矿物和碱性缓冲液的组合可用于从复杂生物测试 样品制备核酸，W用于分子分析程序，例如PCR。有利的是，运些试剂可W用于制备一个测试 样品，用于同时检测DNA和RNA祀分子，而无需进一步纯化或分离核酸，运相对于现有技术 水平是巨大的提高。不受理论的束缚，相信粘±矿物提供几种有益效果，包括，但不限于，保 护核酸在碱性条件下不被水解；保护核酸不发生核酸酶介导的降解；保护下游测定试剂， 例如DNA聚合酶不受测试样品中存在的抑制剂和其它污染物影响；W及一般性缓冲性质。
[0032] 本发明设及微流体装置，它包含内置的粘±矿物和碱性缓冲试剂，用于制备和分 析核酸样品。在一些实施方案中，该装置进一步包含多个微流体通道、进口、阀、膜、累、和 其它部件，它们W各种配置方式布置，控制流体样品的流动，W从样品提取核酸，并进行可 选的后续分子分析。本发明的装置可W进一步包括复合膜，用于从全血样品分离血清样品。 在下面的描述中，说明了本发明装置和方法的特定实施方案，但是，本领域技术人员将会理 解，下述的不同的实施方案和要素可W组合或改变，而不背离本发明的精神和范围。
[0033] 1.定全
[0034] 测试样品：测试样品包括生物样品化iologicalsamples)或"生物样 化i0samp1eS)"，其可W是临床样本。可W测试的代表性的生物样品包括，例如：血液、血清、 血浆、血沉栋黄层、唾液、伤口渗出液、脈液、肺和其它呼吸系统吸出物、鼻吸出物和洗涂物、 窦引流物、支气管灌洗液、疲液、中耳和内耳吸出物、囊肿吸出物、脑脊液、粪便、腹泻液、尿 液、泪液、乳房分泌物、卵巢内容物、腹水液、粘液、胃液、胃肠道内容物、尿道分泌物、滑液、 腹膜液、胎便、阴道分泌物或溢液、羊水、精液、阴茎溢液、等等。对于代表粘膜分泌物和上皮 细胞的拭子或灌洗液的测定是可接受的，例如咽喉、扁桃体、牙銀、鼻腔通道、阴道、尿道、直 肠、下部结肠、和眼部的粘膜拭子，W及各种组织样本的匀浆物、溶解产物和消化产物。哺乳 动物细胞是可接受的样品。除了生理性流体或生物流体之外，水样、工业废水、食品、乳类、 空气过滤液等等也是测试样本。在一些实施方案中，测试样品直接被放置在所述装置中；在 其它实施方案中，预分析过程在设想之内。
[0035] 生物检测祀分子：或"目标核酸"、或"祀分子"，包括一种或多种核酸。祀核酸包括 基因、基因部分、基因的调控序列、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、cDNA，并且可W是单链的、双链 的或=链的。一些核酸祀具有多态性、缺失和可变剪接序列。
[0036] 粘±矿物：或"粘±"指含水侣娃酸盐或含水儀娃酸盐（包括页娃酸盐），其具有 层（薄片状）结构和非常小的颗粒尺寸（通常小于2微米）。粘±矿物可化含有显著量的 铁、碱金属、或碱±金属。粘±矿物构成天然存在的粘±和粘±岩的主要矿物储备，并且可 w由运些地质沉积物来生产。粘上矿物还可w来自于其他天然来源，例如粉砂岩、黏板岩、 一些砂子和砂岩。粘上矿物还可W通过合成产生。
[0037] 页娃酸盐（phyllosilicate):包括许多被称为层状娃酸盐（sheetsilicates)的 矿物，其形成娃酸盐四面体的平行层，成分是Si2〇e或娃与氧的比例为2: 5。页娃酸盐包括下 述族：叶蛇纹石和纤维蛇纹石的蛇纹石族、鱼眼石族、葡萄石族、和粘±矿物族，如下所述。 运些页娃酸盐中的任一种（包括已知为滑石的矿物）适用于本发明。
[0038] 病原体：与感染或感染性疾病相关的生物体。
[0039] 病况：哺乳动物宿主的状况，其特征在于缺少健康，即疾病、虚弱、发病、或者与潜 在的发病相关的遗传特征。
[0040] 不同的实施方案包括能够分析测试样品的微流体装置，所述样品包含一种或多种 祀感染原。示例性的祀感染原包括微生物和/或病毒，所述病毒具有基于DNA的基因组或 基于RNA的基因组。在一些实施方案中，适合的病毒包括，但不限于，乙型肝炎病毒（皿V)、 丙型肝炎病毒（HCV)、人免疫缺陷病毒化IV)I和II、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道 合胞病毒巧SV)A和B、人偏肺病毒（MPV)