(2)浓缩稀甲醇提取液：将稀甲醇提取液减压浓缩得甲醇浸膏266g，在减压浓缩 过程中回收甲醇；
[0044] (3)萃取：把甲醇浸膏溶于蒸馏水中，再用乙酸乙酯萃取，得稀乙酸乙酯萃取液；
[0045] (4)浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将稀乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏 (53g)，在减压浓缩过程中回收乙酸乙酯；
[0046] (5)柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入硅胶层析柱，硅胶粒度200~ 300目，用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比9 :1，将洗脱液进行薄 层检测，浓缩合并类似洗脱流分，静置，过滤得狭叶凤尾蕨甲素粗品；
[0047] (6)单体化合物的纯化：狭叶凤尾蕨甲素粗品用甲醇反复重结晶得本发明的狭叶 凤尾蕨甲素（30mg)。
[0048] 二、结构鉴定
[0049] 狭叶凤尾蕨甲素的理化性状如下：白色絮状固体，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙 酮、甲醇等有机试剂，熔点为246~248 °C ;光学活性，[a ] nD-5. 66 ° (c2. 12, MeOH); UV (CH3OH) λ nax204nm ; IR (KBr) v nax 3386cm 1 (-OH);高分辨质谱给出分子离子峰 m/z 345. 2405 [M+Na] + (计算值为345. 2400得出分子式为C2qH34O3)。1H与 13CNMR数据见表1，同 时，通过测定二维H-H相关谱（1H-1H COSY) JH-13C相关谱（HMQC) JH-13C远程相关谱（HMBC) 以及旋转坐标系NOE谱（ROESY)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化 学结构（见1-图6)。化学结构式如下：
[0051 ] 表1.本发明化合物的1H和13C NMR数据.
[0052]
[0053] 注：JEOL 500ΜΗΖ; δ化学位移单位ppm，1H-NMR和13CNMR分别以溶剂中残存的甲醇 (δ h3. 31ppm)和氘代甲醇为内标（δ c49. Oppm);核磁共振信号的归属是在HMQC、HMBC等二 维谱基础上完成的。
[0054] 通过分析HMBC图谱的碳氢远程相关和HSQC碳氢进程相关以及1H-1H COSY光谱数 据（图7)，3个连有羟基的碳原子可以被定位。首先，通过已知甲基C-18和C-19氢谱的单 峰信号[ 5"0.93013-18)，0.87013-19)]，和130匪1?中5 ￡51.9(〇相关推测该碳原子为(：-3， 并通过 H-2 ( δ H3. 87)和 Η2-3 ( δ Hl. 〇7and 1. 72)的1H-1H COSY 相关确定羟基连于 C-2 上。 HMBC图谱中的甲基信号C-17( δ Hl. 18)和δ c77. 4以及81. 1相关推测该碳原子为C-13和 C-16〇
[0055] 在ROESY图谱中（图7)，H-2 ( δ η 3. 87)和H2-20相关推测C-2上的H原子为β 构型。Η-5 ( δ η 0· 82)和Η3-18相关推测Η-5为β构型。此外，Η-9 β构型的（δ η 0· 96) 是由Η-9和Η-5的相关信号推测出来的。
[0056] 为了更进一步确定化学结构，将本发明所述化合物在甲醇中结晶来得到一个无色 透明的晶体。通过X-ray衍射仪测试得到其空间结构为PSJJ 1，晶体结构见（图8).就像 常见的香茶菜属植物，凤尾蕨属植物中所含的贝壳杉烷型二萜化合物全部都为对映构型 [7-13].由于相同的生物衍生途径，本发明化合物同样也是一个对映-贝壳杉烷型的二萜 化合物。因此本发明化合物的结构被确定为对映 -2 β，13 α，16 α -三羟基-贝壳杉烷，并 因此命名为狭叶凤尾蕨甲素。
[0057] 三、生物活性测定
[0058] 本发明所述化合物的细胞毒活性实验是通过人的肿瘤细胞包括KB(表 皮），HCT116 (结肠），Α549 (肺）和MCF-7 (乳腺）细胞测试的.然而在20mg/mL并未检测 到对这些癌细胞的具有抑制作用。由于非常低的细胞毒活性，本发明所述化合物进一步测 试了其抗真菌活性。
[0059] 牙菌和足癣的活性实验（表2)表明本发明所述化合物在20mg/mL没有对于 Streptococcus mutans和S. sobrinus两种真菌的抗微生物活性。
[0060] 表2.化合物对两种牙菌和足癣的抗微生物活性
[0062] a化合物浓度20mg/mL.
[0063] b化合物浓度10mg/mL.
[0064] 。化合物浓度12mg/mL.
[0065] 本发明所述化合物接着测试了其抗HIV活性：
[0066] IgIC50= Ig最大剂量-Ig(最大剂量/相临剂量）*(阳性反应率之和-(3-最大 阳性反应率-最小阳性反应率）+4)
[0067] 所用细胞株为：293T人胚胎肾细胞和A549人肺上皮细胞。
[0068] 实验方法："一石二鸟"法：HIV/VSV_G通过转染3克VSV-G包膜细胞来进行培养。 转染8小时之后，更换培养媒介为DMEM。48小时后，收集上清液，通过0. 45 μ M-孔隙尺寸 的过滤器过滤。过滤后的病毒准备用于感染。将Α549细胞（人肺上皮细胞）接种在96孔 板，通过加入20、10、5、2. 5、I. 25、0. 625和0. 3125 μ g/mL的溶液的化合物和190 μ L的病毒 与靶细胞一起培养。感染48小时后，裂解细胞并且使用荧光素酶（Promega)进行检测。其 IC5。值为9. ImM且选择系数为12. L详见表3和图9.
[0069] 表3狭叶凤尾蕨甲素对S18。细胞和H 22细胞增值的抑制作用
[0071] 总结：狭叶凤尾蕨甲素对HIV病毒有抑制作用，可用于研制治疗艾滋病的药物。
【主权项】
1. 一种对映-贝壳杉烷型二萜化合物，其特征在于：所述化合物化学名为对 映-2P，13a，16a-三羟基-贝壳杉烧，分子式为C2()H3(j03，化学结构式如下：2. -种如权利要求1所述的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于： (1) 甲醇冷浸提取：取阴干的狭叶凤尾蕨叶，经粉碎后用甲醇冷浸提取，减压浓缩，得 稀甲醇提取液； (2) 浓缩稀甲醇提取液：将稀甲醇提取液减压浓缩得甲醇浸膏； (3) 萃取：甲醇浸膏用蒸馏水溶解，再用乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯萃取相，得稀乙 酸乙酯萃取液； (4) 浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将稀乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏； (5) 柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200~300目，用 石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱流分，静置，过 滤，得粗品。 (6) 单体化合物的纯化：粗品用甲醇反复重结晶，即得。3. 如权利要求2所述的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于：所述 步骤（1)中，甲醇浓度为85%~95%，提取次数为2-4次，每次2-4日。4. 如权利要求3所述的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于：所述 步骤⑴中，甲醇浓度为95%，提取次数为3次，每次3日。5. 如权利要求2所述的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于：所述 步骤⑶中，乙酸乙酯萃取3~4次。6. 如权利要求2所述的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于：所述 步骤（5)中洗脱剂石油醚-乙酸乙酯的体积比为1 :0、9 :1、7 :1或5 :1。7. 如权利要求6所述的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于：所述 步骤（5)中洗脱剂石油醚-乙酸乙酯的体积比为9 :1。8. 权利要求1所述对映-贝壳杉烷型二萜化合物在制备抗病毒药物中的应用。9. 权利要求1所述对映-贝壳杉烷型二萜化合物在制备抗HIV药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种对映-贝壳杉烷型二萜化合物及其制备方法和应用，具体是从凤尾蕨科凤尾蕨属植物狭叶凤尾蕨(Pteris？henryi？Chirst)中提取分离得到，称为狭叶凤尾蕨甲素。研究证实，狭叶凤尾蕨甲素有明显的抗病毒、抑制HIV病毒的活性。狭叶凤尾蕨甲素经超导核磁共振波谱，高分辨质谱，傅立叶变换红外光谱等多种手段检测，确定其分子式为C20H34O3，分子量为345.2405，化学结构式为：。
【IPC分类】C07C35/44, A61P31/18, C07C29/76, A61P31/12
【公开号】CN105218320
【申请号】CN201510631170
【发明人】潘炉台, 张宏杰, 张敬杰, 王娟, 李宛霏
【申请人】贵阳中医学院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月29日