[0030] 所述编码八因子的基因还可W包括标记基因（例如，编码0-半乳糖巧酶、绿色巧 光蛋白或其它巧光蛋白的基因）。所述编码八因子的基因还可W包括通常与转录序列相关 的相关转录调控序列，例如聚腺巧酸化位点和下游增强子元件。运些均为本领域技术人员 所公知，本发明在此不再寶述。
[0031] 根据本发明，W上编码ICP的基因的敲除可W采用本领域常规的各种方法，本发 明对此并没有特别的限制，例如，通过同源重组的方式，通过定点敲除的方式。在了解了本 发明的发明目的W及本发明使用的病毒载体的前提下，本领域技术人员根据其掌握的常规 技术手段能够实现对所述编码ICP的基因的敲除。
[0032] 另外，所述编码八因子的基因的插入也可W采用本领域常规的各种方法，所述插 入的方式可W为直接在选定的插入位点插入所述目的基因，也可W通过同源重组的方式替 换部分碱基序列从而插入所述目的基因，本发明优选后者。
[0033] 优选的，所述编码八因子的基因的核巧酸序列如SEQIDNo:1所示。此处需要说明 的是，根据如上的基因序列和密码子的偏好性所获得基因序列同属于本发明的保护范围。
[0034]单纯瘤疹病毒化e巧essimplexvirus,服V)呈球形，完整的单纯瘤疹病毒由核 屯、、衣壳、被膜灯egument)和囊膜组成。该病毒的核屯、含有双链DNA，缠绕成纤丝卷轴。衣 壳呈二十面体对称，直径为100纳米左右，由162个壳微粒组成。衣壳外由厚薄不匀的被膜 覆盖。病毒最外层为典型的脂质双层囊膜。包括囊膜的病毒直径为150-200纳米。单纯瘤 疹病毒包括I型单纯瘤疹病毒Ofe巧esSimplexVirusTypeI，HSV-1)W及II型单纯瘤 疹病毒。本发明的单纯瘤疹病毒载体优选通过对I型单纯瘤疹病毒进行基因改造获得。
[0035] 根据本发明，所述I型单纯瘤疹病毒优选分离自亚洲人种感染的I型单纯瘤疹病 毒，在该优选的情况下，本发明对亚洲人群更具有针对性。
[0036] 第二方面，本发明提供了一种用于制备如上所述的重组单纯瘤疹病毒的宿主细 胞，其中，所述细胞具有表达编码感染细胞多肤4的基因W及可选择的表达编码感染细胞 多肤27的基因。
[0037] 重组单纯瘤疹病毒与正常单纯瘤疹病毒一样，也需要在宿主细胞内完成其生活 史，因此所述重组病毒的传代增殖需要在宿主细胞中进行。所述宿主细胞可W是各种能够 培养本发明病毒载体和/或重组病毒的宿主细胞，例如非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）、仓鼠 肾细胞度HK细胞）、原代兔肾细胞、鸡胚细胞、羊膜细胞、人宫颈癌细胞Ofela细胞）W及人 胚肺二倍体成纤维细胞（WI-38细胞）。
[0038] 根据本发明，由于本发明提供的重组单纯瘤疹病毒敲除掉了编码感染细胞多肤4 的基因W及可选择的表达编码感染细胞多肤27的基因，因此，在正常的宿主细胞中其不能 够进行正常的繁殖。本发明通过将用于制备所述重组单纯瘤疹病毒的细胞进行基因改造， 使其宿主细胞能够表达编码感染细胞多肤4的基因W及可选择的表达编码感染细胞多肤 27的基因，从而能够为本发明的重组单纯瘤疹病毒的繁殖提供必要的条件。
[0039] 第=方面，本发明还提供了一种感染有病毒的宿主细胞，其中，所述病毒为本发明 的重组单纯瘤疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肤4的基因和可选择的表达编码 感染细胞多肤27的基因。
[0040] 所述宿主细胞的具体选择可W参照如上所列举的进行。
[0041] 第四方面，本发明还提供了如上所述的重组单纯瘤疹病毒、如上所述的用于制备 病毒的宿主细胞和/或如上所述的感染有病毒的宿主细胞在制备用于治疗和/或缓解血友 病的药物中的应用。优选的，所述血友病为A型血友病。
[0042]W下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0043]W下实施例和对比例中：
[0044] 本发明的编码八因子的基因的核巧酸序列如SEQIDNo:1所示。
[0045]Vero细胞，用携带ICP4和/或ICP27编码基因的质粒转染Vero细胞，采用筛选抗 生素G418筛选阳性克隆，扩增得到构建的宿主细胞。
[0046] 实施例1
[0047] 本实施例用于说明本发明重组单纯瘤疹病毒的构建
[004引按照申请号2004100064921，授权公告号CN1283803C的专利申请中记载的方法将 野生型临床分离服V-I病毒的ICP34. 5基因和ICP4基因敲除，并在服V-I载体的潜伏表达 区（LAT区）启动子下游核巧酸119499bp-122025bp处插入携带CMV启动子的编码八因子 的基因。在北京S博远志公司测序鉴定ENK基因正确插入到单纯瘤疹病毒载体中。构建成 功的病毒载体在能够表达ICP4基因的构建的Vero宿主细胞系上于37°C、5%C02下增殖， 感染复数为0. 1，收获后用0.65ym滤器去除细胞碎片，然后在1300化pm条件下高速离屯、纯 化，得到的产品用于动物实验。
[004引 实施例2
[0050] 本实施例用于说明本发明重组单纯瘤疹病毒的构建
[0051] 按照实施例1中的方法进行重组单纯瘤疹病毒的构建，不同的是，敲除的基因为 HSV-I病毒的ICP：M. 5、ICP27 和ICP4 基因。
[00閲 实施例3
[0053] 本实施例用于说明本发明重组单纯瘤疹病毒的构建
[0054] 按照实施例1中的方法进行重组单纯瘤疹病毒的构建，不同的是，编码八因子的 基因插入到的是服V-I病毒的ICP34. 5基因处。
[00财 实施例4
[0056] 本实施例用于说明本发明重组单纯瘤疹病毒的构建
[0057] 按照实施例1中的方法进行重组单纯瘤疹病毒的构建，不同的是，编码八因子的 基因插入到的是服V-I病毒的ICP4基因处。
[00则对比例I
[0059] 本对比例用于说明参比的重组单纯瘤疹病毒的构建
[0060] 按照实施例1中的方法进行重组单纯瘤疹病毒的构建，不同的是，敲除的基因为 HSV-I病毒的ICP4和ICP27,并且编码ENK的基因仅插入到ICP4基因处。
[00川测试例
[0062]由于FVIII因子KO小鼠体内不存在任何凝血VIII因子，因此在FVIII KO小鼠中 可W很好的观察病毒载体对血友病A的生理改善情况，出血时间的变化是病理状态改善最 直接的显示。
[006引购买8-10周龄，20-24g的FVIII因子KO小鼠和正常小鼠。将54只FVIII KO小 鼠分为8组，每组6只FVIII KO小鼠，另设6只正常小鼠做对照。试验小组分别是：第1组 注射100 y 1的PBS，第2组注射100 y 1空白载体对照，第3-7组分别注射100 y 1的实施例 1-4和对比例1所制备的重组单纯瘤疹病毒，第8组不做任何处理。
[0064]在注射病毒30天时，通过小鼠剪尾测出血时间的方法检测注射病毒后FVIII KO小鼠出血时间的变化。结果见表1 [00巧] 表1
[006引由W上结果可W看出，相比于对比例1，本申请实施例1-4的重组病毒载体对小鼠 凝血功能改善显著，此外，本申请实施例1的重组病毒载体对小鼠凝血功能改善最为显著。 而PBS和空白载体对小鼠凝血功能基本没有改善。
[0069] W上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可W对本发明的技术方案进行多种简单变型，运 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0070] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可W通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0071] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可W进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于，所述重组单纯疱疹病毒包括单纯疱疹病毒载 体和编码八因子的基因，所述单纯疱疹病毒载体是通过使单纯疱疹病毒缺失编码感染细胞 多肽34. 5的基因和编码感染细胞多肽4的基因、以及可选择的缺失编码感染细胞多肽27 的基因得到的，所述编码八因子的基因的插入位点包括插入在所述单纯疱疹病毒载体的潜 伏相关转录子编码区，并且在所述编码区的启动子下游，和/或至少一处缺失了所述编码 感染细胞多肽的基因处。2. 根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述编码八因子的基因还包括启 动子、起始密码子和终止密码子。3. 根据权利要求2所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述启动子选自CMV启动子、MMLV 启动子和RSV启动子所组成的组中。4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述单纯疱疹病毒 分离自亚洲人种。5. 根据权利要求1-4中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒，其中，所述单纯疱疹病毒 为I型单纯疱疹病毒。6. -种用于制备权利要求1-5中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒的宿主细胞，所述 细胞具有表达编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达编码感染细胞多肽27的基因。7. -种感染有病毒的宿主细胞，其特征在于，所述病毒为权利要求1-5中任意一项所 述的重组单纯疱疹病毒，所述细胞具有表达编码感染细胞多肽4的基因以及可选择的表达 编码感染细胞多肽27的基因。8. 权利要求1-5中任意一项所述的重组单纯疱疹病毒、权利要求6所述的用于制备病 毒的宿主细胞和/或权利要求7所述的感染有病毒的宿主细胞在制备用于治疗和/或缓解 血友病的药物中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其中，所述血友病为A型血友病。
【专利摘要】本发明涉及生物医药领域，公开了一种重组单纯疱疹病毒，包括单纯疱疹病毒载体和编码八因子的基因，该载体通过使单纯疱疹病毒缺失编码感染细胞多肽34.5和4的基因、以及可选择的缺失编码感染细胞多肽27的基因得到，所述基因插入到潜伏相关转录子编码区的启动子下游，和/或至少一处缺失了编码感染细胞多肽的基因处。还提供了制备和感染有如上病毒的宿主细胞、如上的病毒和宿主细胞在制备用于治疗血友病的药物中的应用。本发明编码八因子的基因能够稳定的表达，且作用效果好，治疗持续时间长，该重组单纯疱疹病毒可感染且不破坏已处于分化状态的骨骼肌细胞；作用时效较其他病毒载体长，可避免注射频率较高；并不整合到宿主细胞基因组上，更加安全。
【IPC分类】C12N7/01, A61P7/04, A61K35/763, A61K35/12, C12N5/10
【公开号】CN105219739
【申请号】CN201510603370
【发明人】于耕, 李劲风
【申请人】北京神源德生物科技有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月21日