的尿蛋白组的 影响的数据。在表3A和B中示出健康儿童的晨间和睡前尿样品中检测到的统计显著的、性 别调节的蛋白质。还示出t检验和G检验的结果。
[0124] 令人关注地，本发明人在晨间和睡前样品中的差异表达蛋白质之间观察到很少的 重复（< 10% )，运表明性别调节的差异也对昼夜影响十分敏感（图化）。例如，女孩睡前的 TRF水平升高，而从男孩收集的晨间尿样品中膜岛细胞再生因子（REGIA)特别地增加（图 2c)。
[0125] 一般而言，相对于昼夜影响性别对尿蛋白组成的影响更显著。与该发现一致，健康 儿童中性别调节的尿蛋白质组的基因本体分析显示通常与性别不相关的功能注释的显著 富集（细胞黏附，P= 6.OX10 7;模式结合，P= 7.OX10 3;补体和凝血级联P= 4. 2X10 3)。 明显不同地，该方法没有在更多直观方面如女性怀孕（P= 0. 11)或胚胎植入（P= 0. 11) 识别出显著性。
[012引 连施俩I4 阳127]化章OSA的尿牛物梳虎物发现高麼依赖于忡别巧替梅的影响[012引与年龄和性别相配的对照一起招募通过多导睡眠记录派生的呼吸暂停低通气指 数的标准（总睡眠时间中AHI> 5个事件/小时）所评估的患有中度至重度OSA的儿童（2 至12岁大）。他们的人口学特征为不存在年龄、性别、种族或BMI分布的统计上的显著差异 (表 4)。
[0129]表4 :对象的人口学和多导睡眠记录的特征
[013。 缩写：BMI:身体质量指数；AHI:阻塞性呼吸暂停-低通气指数；OSA=阻塞性睡眠 呼吸暂停。在适用情况下，结果表示为平均值+平均值标准误差。
[0132] 使用严格的质量和蛋白质检测重复性的标准，尿样品的质谱分析在所有患者样品 中识别出742种尿蛋白质。
[0133] 为了研究性别和昼夜变化对生物标志物发现的影响，本发明人WS种方式进行了 统计分析（使用t检验和G检验；（Becker, 2010 ;01d，2005 ;Heinecke，2010))(图 3a)。在 水平1分析中，将晨间和睡前样品中的蛋白质水平进行平均并且不根据性别来区分组。水 平2分析独立地研究晨间和睡前样品，而水平3分析按收集时间和性别依赖的方式处理样 品（图3a)。
[0134] 在水平1分析中识别了儿童OSA的六种候选生物标志物（表5A)。特别地，在该分 析中也检测到了血清类黏蛋白1 (OMl)，一种在之前的OSA生物标志物筛选中最初识别的 蛋白质（Gozal，2009)。然而，ORMl的统计显著性水平几乎不超出统计阔值，且之后的化ISA 测量没能验证运个发现。当独立地处理晨间和睡前样品时检测到的生物标志物的数量的大 幅增加是明显的（水平2,45种蛋白质），当在分析中也考虑性别时看到了进一步的、更为显 著的增加（水平3,192种蛋白质）（图3曰，表5A-D)。表5A-D公开了儿童OSA的尿生物标 志物的识别。相对于对照样品在OSA中差异表达的尿蛋白质的识别。示出水平1(所有样 品）、水平2 (校正昼夜影响）和水平3 (校正昼夜和性别的影响两者）的生物标志物分析的 结果W及相应的t检验和G检验的值。
[0135]
[0152] 一般而言，晨间尿样品的差异表达蛋白过多，运是主要基于OSA对男孩尿蛋白组 的强烈影响的结果（图3b)。该观察结果并不令人意外，因为OSA是W夜间的重复呼吸事件 为特征的睡眠疾病，因此运些事件更有可能会表现在晨间尿中；然而，在女孩中出现相反的 结果，其中睡前尿样品产生更高数量的候选生物标志物（图3b)。此外，因为在男孩和女孩 中通过晨间和睡前样品识别的候选生物标志物中观察到低重叠（约3% )，所W差异表达蛋 白对于性别和取样时间是高度特异的。重要地，所检测生物标志物的性别差异不能用年龄、 疾病严重度或肥胖度MIZ分数）来解释，因为运些参数在组之间没有显著差异（图3c)。
[0153] 综上，结果表明没能解释取样时间和性别基本上掩盖了与疾病状态如OSA相关的 蛋白质表达的显著差异。利用t检验和G检验通过晨间尿样品的全蛋白质组学分析清楚地 说明了运个概念，其显示生物标志物识别的数量和统计显著性的大幅提高（图3d)。利用二 肤基肤酶4值PP4)作为实例（图3e)，在个体蛋白质水平上出现相似的结论。
[0154]连施俩I5 阳1巧]輪证通过帝白质紀学分析巧别的候洗牛物梳虎物
[0156] 为了验证发现，本发明人使用可商购的化ISA分析来测量4种候选生物标志物的 尿水平。因为尿中蛋白质水平是高度变化的，并且受体液量影响，所W所有的测量值均针对 相应的尿肌酢水平进行标准化（Garde, 2004)。ELISA测量值通常与通过MS/MS的无标记定 量很好地相关（例如，HPX，P< 0. 0001，R2= 0. 52 ;图4a)，并提供蛋白质水平的性别调节 和昼夜调节的有力验证（例如，DPP4,比较图3d和4b)。总体上，ELISA分析提供在蛋白质 组学分析中检测的四种候选生物标志物的蛋白质水平改变的独立确认：DPP4(p= 0.02)， HPX(P= 0. 02)，和CP(P= 0. 01)作为男孩中OSA的可靠指示剂出现，而在女孩中识别了 AZGPl(P= 0. 07)(图4b，C)。此外，因为化ISA分析设及尿样品的最少处理（离屯、），而蛋 白质组学分析需要大量处理（离屯、、IgG和ALB移除、蛋白质沉淀、样品消化等），运两种方 法之间的强相关性进一步表明用于尿生物标志物发现的该经优化的蛋白质学工作流程方 法是稳定的。 阳157]连施俩I6 阳15引 化科OSA的尿牛物梳虎物映射到病理牛理学横块
[0159]在从患有OSA的儿童收集的尿中已经识别了多种候选生物标志物，本发明人接下 来尝试确定运些蛋白质是否与特定功能途径相对映。为此，本发明人使用基因本体分析来 根据生物过程和分子功能将192种蛋白质整理成功能模块（图5)。该策略在许多功能注释 中识别出显著的富集（相对于整个人类基因组），功能注释包括急相蛋白（P= 8. 4X10 5)、 血管生成（P= 2. 7X10 3)、止血（P= 4. 2X10 8)、白细胞免疫（P= 2. 4X10 2)和脂质结 合（P= 2. 3X10 4)。在先的研究提供全部运些途径在OSA中受影响的证据。例如，炎症 /免疫的中断、脂质、血管生成和止血途径在患有OSA的患者中都有报道（Adedayo,2012 ; Qiorostowska-Wyni址〇,2005 ;Slupsky，2007;vonKanel，2007)。 阳160]连施俩I7
[0161] 患有OSA的化章思示巧损伤的择质忡
[0162] 被充分证实的是患有OSA的儿童显示神经认知缺陷和降低的学业表现（Gozal等 人，2010;Blunden等人，2000;Gottlieb等人，2004 ;Kheirandish&Gozal, 2006 ;0,Rrien 等人，2004 ;化odes等人，1995 ;Gozal&Kheirandish-Gozal，2007 ;Gozal，1998)。陈述性 记忆功能是学业表现中的重要构成，研究表明OSA儿童获取、巩固和检索记忆的能力降低 (Keirandish-Gozal等人，2010)。为了继续该在先工作，本发明人招募患有中度至重度OSA 的儿童巧至12岁大）化及年龄和性别相配的对照。本发明人通过多导睡眠记录来评估它 们的睡眠结构，并使用之前用来在患有OSA的患者中识别神经认知缺陷的常规使用的陈述 性记忆测试（Keirandish-Gozal等人，2010)来定量他们的记忆功能。
[0163] 总计，招募了 33个儿童，其中20个对象在OSA组，13个对象在对照组。平均年龄 是约7. 5岁。两组的年龄、性别、种族、母亲的教育水平和通过BMIZ分数确定的肥胖是相 配的。另外，医生诊断的哮喘的发病率在两组之间是相似的。患有OSA的儿童具有显著更 高的呼吸暂停-低通气指数（AHI;p< 0. 0001)，呼吸暂停-低通气指数是一种睡眠呼吸暂 停的严重度的量度（Grigg-Damberger等人，2007 ;Redline等人，2007)。
[0164] 表6:患者人口学特征
[0166]OSA组显示在晨间降低的自由记忆回忆的趋势（P=O. 1)。在更仔细检查数据后， 明显的是OSA患者，而非对照对象，在其晨间测试表现得分中显示显著的异质性（图6A)。 基于该异质性，本发明人将OSA儿童分成两个表型一一个具有正常陈述性记忆（0SA-N，> 7个回忆），一个具有受损的陈述性记忆（0SA-I，《7个回忆）。重要地，OSA-N和OSA-I患 者不显示OSA严重度（图6B)、潜在的肥胖（图6C)、年龄（图抓）或性别（0SA-N和OSA-I 的50%男性）的显著差异。因此，不能将OSA-N和OSA-I患者中晨间记忆回忆的差异归因 于睡眠中断的严重度或任何其他可能的混杂因素。
[0167] 尿蛋白质组学识别患OSA儿童中受损记忆的候选生物标志物。本发明的发现证明 根据获取、巩固或检索记忆的相关受损的严重度可W将患有OSA的儿童分成两个表型。在 分子水平上，运个观察到的表型异质性可W通过对OSA的变化全身响应来解释，运在儿童 中已有报道（Gozal等人，2007 ;化attacharjee等人，2010)。尿蛋白质组大部分来源于全身 隔室，本发明人之前已经证明尿蛋白质的变化可W报告OSA的情况下的病理生理学（Gozal 等人，2009)。
[016引为了使患OSA的儿童中记忆受损的候选生物标志物明确，本发明人使用液相色谱 质谱（LC-MS/M巧来研究从健康儿童（N= 13)、0SA-N(N= 8)和OSA-I(N= 12)患者收集 的晨间尿样品（首次排尿）。使用严格且可重复的工作流程处理尿W用于蛋白质组学分析 来识别所有对象中的745种尿蛋白质。通过谱计数来定量蛋白质水平化iu等人，2004)，并 使用G检验和t检验的组合来识别组间不同丰度的蛋白质度ecker等人，2010 ;Becker等 人，2010 ;Heinecke等人，2010 ;Almen化OS等人，2014)。使用非常严格的双重统计标准（G 检验：G统计量> 10,t检验：P< 0. 01)和随机置换分析来确保假发现率（抑时< 0. 1%， 本发明人识别了相对OSA-N患者在OSA-I中改变显著的65种蛋白质。（图7A)。执行相同 的方法来识别相对对照对象在OSA-I中改变显著的93种蛋白质（数据未示出）。候选生物 标志物被定义为相对于OSA-N和对照对象二者在OSA-I中一致增加（或减少）的那些蛋白 质。该分析产生了患OSA的儿童中52种记忆受损的候选生物标志物的列表（表7);提供 丛生蛋白（CLU)和憐酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白质I(PIK3IP1)作为满足运些非常严格 的标准的蛋白质的两个实例（图7B)。
[0169]表7:患有阻塞性睡眠呼吸暂停的儿童中记忆受损的候选生物标志物
[0173] 蛋白质是通过谱计数定量的。
[0174] 通过t检验（P< 0. 01)和G检验（G统计量> 10或< -10)来评价统计显著性； 正G=在第一个样品中相对第二个上调，负G=在第一个样品中相对第二个下调。
[01巧]令人关注地，候选生物标志物的信息学分析识别了炎症反应的显著富集（P= 10 6;用Benjamini-Hochberg校正的Fisher精确检验）。运些发现与证明血浆C反应蛋白 水平（炎症的一种标志物）与患OSA儿童的神经认知功能之间强相关的在先研究（Gozal 等人，2007) -致。综上，运些数据表明OSA相关的炎症的存在会使儿童易患记忆缺陷和神 经认知损伤。
[0176] ELISA分析验证蛋白质组学数据并使得能够进行高通量临床筛选。为了验证质谱 发现，本发明人使用可商购的化ISA分析来测量患OSA儿童中2种记忆损伤的候选生物标 志物血液结合素（HP讶和血浆铜蓝蛋白（CP)的尿水平。作为对照，本发明人还对在对照、 OSA-I和OSA-N对象中水平未改变的蛋白质，即尿调节素的尿水平进行定量。因为尿中蛋白 质水平是高度变化的，并且受体液量影响，所W所有的测量值均针对相应的尿肌酢水平进 行标准化（Garde等人，2004)。ELISA分析重现通过质谱分析预测的HPX、CP和UM孤的调 节模式（图8A-C)。运些发现提供对蛋白质组学和统计方法用于识别患OSA儿童中记忆受 损的候选生物标志物的有力验证。此外，用于Hra和CP的化ISA分析的开发使得能够进行 高通量临床筛选。 阳177] 连施俩I8 阳17引 开发用于患OSA化章中陈沐忡巧缺胳的候洗尿牛物梳虎物的高通量化ISA分析
[0179] 使用基于发现的蛋白质组学，本发明人在患OSA儿童中识别了 52种陈述性记忆缺 陷的候选生物标志物，并通过化ISA进一步验证了运些蛋白质中两种OPX和(P)的蛋白质 丰度（通过质谱测量）变化。经验证的候选生物标志物将被用于开发多变量分类器（组合 板），使用高通量化ISA分析在更大的独立患者群中研究其预测能力。
[0180] 实验设计。研究会使用经蛋白质组学分析的先已存在的尿样品来验证将OSA-I患 者与对照和OSA-N对象区别的候选生物标志物（参见图6-8)。基于统计显著性和尿蛋白水 平变化的量级（通过t检验和G检验评估）、ELISA相容的抗体和/或试剂盒的可用性、和 生物功能，本发明人已经选择了 10种候选者用于最初测试（表8)。
[0181] 表8 :用于化ISA分析开发的候选者
[018引*，负的G检验=在OSA-I中相对于OSA-N减少
[0184] **，已经开发的尿ELISA分析
[01财 通过化ISA定量尿帝白质。报据制推商的方案伸用可商购的用于CP、PR0CR、AP0H、 KNGl(Assaypro)，HPX(InnovativeResearch,Inc. )，PIGR、RNA沈 1、C0L12A1、CTBS(USCN LifeScience)，CD59(Neobiol油）和肌酢（Abeam)的化ISA来定量尿蛋白质。为了说明变 化的水合状态，所有蛋白质水平会被标准化为尿肌酢水平（Gar壯e等人，2004)，并会通过 双尾学生t检验来评价组之间的统计显著性。运会证明先前识别的案例与对照样品（即 OSA-I和0SA-N)之间的差异在使用独立的技术（即化ISA)测量候选生物标志物时仍然存 在。本发明人已经证实了关于先前分析过的患者中的HPX、CP和UMOD的蛋白质组学发现。 阳18引 连施俩I9 阳187] 确定候洗尿牛物梳虎物在患OSA化章的审大的她立掛体中的预郷怡良力
[0188] 通过芝加哥大学的儿童睡眠实验室研究的儿童会经历多导睡眠记录、记忆测试、 并提供尿样品用于生化分析。最初的测量会集中在Hra和CP，它们是本发明人已经通过 ELISA验证过的。另外的候选生物标记会在实施例8中进行化ISA分析时进行测试。
[0189] 实验设计。会根据人类研究机构指南招募满足该研究的入选标准的儿童。所有参 与的儿童都会进入芝加哥大学儿童睡眠实验室留下过夜。会通过多导睡眠记录评估OSA严 重度，会通过经验证的图像记忆测试烟leirandish-Gozal等人，2010)来评估陈述性记忆， 并会收集晨间尿样品用于生化分析（图9)。最初的测量会集中在Hra和CP，因为本发明人 已经开发了用于运些候选生物标志物的化ISA分析。随着化ISA分析的开发会测试另外的 候选生物标记。
[0190] 患者选择。该研究的目标人群由在芝加哥大学睡眠医学中屯、临床评估打韩的5至 12岁大的儿童组成。该机构每年评价超过1250名儿童，运些中约80%患有作为其临床推 荐的主要原因的打韩和疑似睡眠障碍性呼吸。会从学校或幼儿保健诊所招募健康儿童（n =50)。患OSA儿童的入选極進会包括使用经广泛验证的调查问卷打韩频率> 3次/周的 儿童。对照和OSA儿童的排除标准会包括存在明显的遗传或顾面综合征、糖尿病、囊胞性纤 维症、癌症，或在用口服皮质类固醇、抗生素或抗炎药物进行治疗。另外，如果参与者患有任 何慢性精神疾病、患有已知影响认知能力的遗传综合征、或正在接受已知干扰记忆或入睡 开始或睡眠结构的药物，则他们会被排除。
[0191] 整夜