] 步骤一、脐带血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于采血袋 中8°C保存，并于6小时内进行分离处理；
[0062]同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检 测及基因检测。
[0063] 步骤二、脐带血分离：将脐带血转移到离心管中，每管25~40ml，并留取血样计血 液成分。2000g，离心lOmin;血浆分装至4. 5ml冻存管，每管4ml;
[0064] 步骤三、脐带血缓慢加上淋巴细胞分离液上，脐带血添加量与分离液分别是30ml 和 15ml，700g离心 19 ~20min;
[0065] 步骤四、收集单核细胞：离心后细胞分层，取单核细胞层，750g离心lOmin;
[0066] 步骤五、合并单核细胞，300g离心lOmin;
[0067] 步骤六、根据需求选择是否进行红细胞裂解。加裂解液2~4ml，时间不超过30s， 使用生理盐水终止裂解，取样计数，300g离心lOmin;
[0068] 步骤七、细胞培养：根据计数结果，调整细胞密度至0. 8~1. 6X 10S/T75瓶；
[0069] 步骤八、单核细胞冻存：细胞培养3-4天，收集细胞计数和活率，冷冻保护液为5% 的血浆和DMS0混合溶液，4°C预冷60min，按1~4Xl〇7ml/管进行冷冻保存；将细胞上清 进行无菌检测、支原体检测；
[0070] 步骤九、单核细胞细胞复苏：取冷冻细胞，40°C，2min内迅速解冻，复苏后用生理 盐水洗涤两遍，300g离心lOmin，计细胞数和细胞活率，并留样进行内毒素和细菌检测，并 用复方电解质溶液混匀。
[0071] 实施例2
[0072] 本实施例提供一种单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
[0073] 步骤一、脐带血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于采血袋 中9°C保存，并于6小时内进行分离处理；
[0074] 同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检 测及基因检测。
[0075] 步骤二、脐带血分离：将脐带血转移到离心管中，每管25~40ml，并留取血样计血 液成分。1700g，离心lOmin;血浆分装至4. 5ml冻存管，每管4ml;
[0076] 步骤三、脐带血缓慢加上淋巴细胞分离液上，脐带血添加量与分离液分别是30ml 和 15ml，650g离心 19 ~20min;
[0077] 步骤四、收集单核细胞：离心后细胞分层，取单核细胞层，650g离心lOmin;
[0078] 步骤五、合并单核细胞，300g离心lOmin;
[0079] 步骤六、根据需求选择是否进行红细胞裂解。加裂解液2~4ml，时间不超过30s， 使用生理盐水终止裂解，取样计数，350g离心lOmin;
[0080] 步骤七、细胞培养：根据计数结果，调整细胞密度至0. 8~1. 6X 10S/T75瓶；
[0081] 步骤八、单核细胞冻存：细胞培养3~4天，收集细胞计数和活率，冷冻保护液为 5%的血浆和DMS0混合溶液，4°C预冷90min，按1~4Xl〇7ml/管进行冷冻保存（_80°C过 夜，第二天转入液氮保存）；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测；
[0082] 步骤九、单核细胞细胞复苏：取冷冻细胞，37°C，2min内迅速解冻，复苏后用生理 盐水洗涤两遍，300g离心lOmin，计细胞数和细胞活率，并留样进行内毒素和细菌检测，并 用复方电解质溶液混匀。
[0083] 实施例3
[0084] 本实施例提供一种单核细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
[0085] 步骤一、脐带血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带血，置于采血袋 中10°C保存，并于6小时内进行分离处理；
[0086] 同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检 测及基因检测。
[0087] 步骤二、脐带血分离：将脐带血转移到离心管中，每管25~40ml，并留取血样计血 液成分。1850g，离心lOmin;血衆分装至4. 5ml冻存管，每管4ml;
[0088] 步骤三、脐带血缓慢加上淋巴细胞分离液上，脐带血添加量与分离液分别是30ml 和 15ml，750g离心 19 ~20min;
[0089] 步骤四、收集单核细胞：离心后细胞分层，取单核细胞层，750g离心lOmin;
[0090] 步骤五、合并单核细胞，350g离心lOmin;
[0091] 步骤六、根据需求选择是否进行红细胞裂解。加裂解液2~4ml，时间不超过30s， 使用生理盐水终止裂解，取样计数，300g离心lOmin;
[0092] 步骤七、细胞培养：根据计数结果，调整细胞密度至0. 8~1. 6X10S/T75瓶；
[0093] 步骤八、单核细胞冻存：细胞培养3~4天，收集细胞计数和活率，冷冻保护液为 5%的血浆和DMS0混合溶液，4°C预冷200min，按1~4Xl〇7ml/管进行冷冻保存；将细胞 上清进行无菌检测、支原体检测；
[0094] 步骤九、单核细胞细胞复苏：取冷冻细胞，40°C，2min内迅速解冻，复苏后用生理 盐水洗涤两遍，350g离心lOmin，计细胞数和细胞活率，并留样进行内毒素和细菌检测，并 用复方电解质溶液混匀。
[0095] 件能测试
[0096] 对实施例1~3制备的单核细胞进行标准检测，检测结果如下表所述：
[0097] 表 1
[0098]
[0099] 4测结果显示，本发^制备方法制备k得的单核细▲的各项标准均4合应用要 求。
[0100] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤： 步骤一、脐带血筛选与保存：将分离、筛选的脐带血置于低温下保存； 步骤二、脐带血分离：对所述保存后的脐带血进行离心，得血浆； 步骤三、加液：向所述血浆中加入淋巴细胞分离液，离心，得单核细胞层； 步骤四、收集单核细胞：取所述单核细胞层，离心，即得单核细胞； 步骤五、细胞培养：取所述单核细胞进行培养，调整细胞密度至设定值； 步骤六、单核细胞冻存：向培养后的单核细胞中加入冷冻保护液，预冷后冻存，即可。2. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤 一中，所述脐带血是从健康足月产妇志愿者中采集、筛选而来； 所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史； 所述低温具体指温度范围为8~KTC。3. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤 二中，所述脐带血的分离需要于低温保存6小时内进行； 所述离心的条件为1700~2000g、10~15min。4. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤 三中，所述血浆与所述淋巴细胞分离液的体积比为2:1 ; 所述离心的条件为650~750g、19~20min。5. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤 四中，所述离心的条件为650~750g、8~lOmin。6. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述 方法还包括在步骤四之后合并、收集单核细胞的步骤。7. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述 方法还包括根据实际需要对红细胞进行裂解的步骤。8. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤 六中，所述冷冻保护液为体积分数为5%血浆的DMSO溶液； 所述冷冻保护液的使用终浓度5%，体积分数。9. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述 冻存具体指预冷后将细胞转入_80°C过夜，然后转入液氮保存。10. 根据权利要求1所述的脐带血单核细胞的制备方法，其特征在于，其特征在于，所 述方法包括在所述单核细胞冻存之后对单核细胞进行复苏的步骤。
【专利摘要】本发明公开了一种脐带血单核细胞的制备方法：步骤一、脐带血筛选与保存：采集、筛选健康足月产妇志愿者脐带血，置于低温下保存；步骤二、脐带血分离：对所述保存后的脐带血进行离心，得血浆；步骤三、加液：向所述血浆中加入淋巴细胞分离液，离心，得单核细胞层；步骤四、收集单核细胞：取所述单核细胞层，离心，即得单核细胞；步骤五、细胞培养：取所述单核细胞进行培养，调整细胞密度至设定值；步骤六、单核细胞冻存：向培养后的单核细胞中加入冷冻保护液，预冷后冻存，即可。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行统一、系统监控，以实现脐带血单核细胞分离、冷冻的标准产品。
【IPC分类】C12N5/0786, A01N1/02
【公开号】CN105238756
【申请号】CN201510707804
【发明人】苏量
【申请人】上海百众源生物科技有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月27日