嵌合抗原受体的制作方法
【专利说明】嵌合抗原受体
[0001] 本申请要求2012年12月20日申请的美国临时专利申请第61/740, 113号和2013 年3月13日申请的美国临时专利申请第61/779, 925号的优先权，所述各临时专利申请通 过引用其全部结合到本文中。
[0002] 1.领域
[0003] 本文中的公开内容涉及免疫学领域，更准确地说涉及T淋巴细胞或其它免疫细胞 的修饰。
[0004] 2.背景
[0005] 免疫系统的细胞（例如T淋巴细胞（也称为T细胞））通过受体或受体复合物识别 特定抗原并与其相互作用，在识别此类抗原并与其相互作用时，引起该类细胞的活化。此类 受体的一个实例是抗原特异性T淋巴细胞受体复合物（TCR/CD3)，一种八个蛋白质的复合 物。T细胞受体（TCR)在T淋巴细胞的表面上表达。具有不变结构的一种组分⑶3在TCR 被配体占据之后负责细胞内信号传递。对抗原-CD3复合物（TCR/CD3)的T淋巴细胞受体 识别由主要组织相容性复合体（MHC)的蛋白质呈递给它的抗原性肽。MHC和肽的复合物在 抗原呈递细胞和其它T淋巴细胞靶标的表面上表达。TCR/CD3复合物的刺激导致T淋巴细 胞的活化并随之发生抗原特异性免疫应答。TCR/CD3复合物在效应功能和免疫系统调节中 起重要的作用。
[0006] T淋巴细胞需要第二信号一共刺激信号（co-stimulatorysignal)才能变成完 全活性的。若没有这样的信号，T淋巴细胞对结合于TCR的抗原无应答，或者变成无能的 (anergic)。这样的共刺激信号例如由⑶28 ( -种T淋巴细胞蛋白）提供，⑶28与产生抗 原的细胞（antigen-producingcells)上的⑶80和⑶86相互作用。IC0S(可诱导共刺激 分子（InducibleCOStimulator))(另一种T淋巴细胞蛋白）当结合于IC0S配体时提供共 刺激信号。CTLA4 (细胞毒性T-淋巴细胞抗原4)，也称为⑶152,是在辅助T细胞和⑶4+T 细胞的表面上表达的一种受体，其下调T细胞活性。CTLA4与其关联配体CD80和CD86的结 合导致T细胞活化和增殖降低。PD-1(编程性细胞死亡-1)，也称为CD279,目前理解为负调 节T细胞受体（TCR)信号并且广泛地负调节免疫应答。
[0007] 已经通过对单多肽链（一般称为嵌合抗原受体（ChimericAntigen Receptor，CAR))的遗传重组方法降低TCR复合物的必需抗原-结合、信号传递和刺激功能。 参见例如，Eshhar，美国专利第7, 741，465号；Eshhar，美国专利申请公布第2012/0093842 号。携带此类CAR的T淋巴细胞一般被称为CAR-T淋巴细胞。CAR经特异性构建以在对CAR 所结合的特定抗原应答时刺激T细胞活化和增殖。
[0008] 3.概沭
[0009] 在一个方面，本文提供的是多肽，例如嵌合抗原受体（参见例如，Eshhar，美国专 利第7, 741，465号），其可由免疫系统细胞（例如，T淋巴细胞（T细胞））表达，在这样的免 疫系统细胞中是膜结合的，并且其包含来自在正常情况下将抑制信号传递至这样的免疫系 统细胞的免疫系统蛋白质的跨膜域（transmembranedomain)，例如来自CTLA4 (细胞毒性 τ-淋巴细胞抗原4或细胞毒性τ-淋巴细胞相关蛋白4)或ro-i(编程性细胞死亡-1)的跨 膜域。
[0010] 在一个实施方式中，本文提供的是多肽，其包含：（i)跨膜域，包含来自CTLA4(例 如，GenBank登记号NM_005214. 4 (CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4 (智人（Homo sapiens));GeneID:1493))或PD-1 (例如，GenBank登记号ΝΜ_005018·2(编程性细胞死 亡1(智人）；GeneID:5133))的跨膜域或其部分，（ii)表达于淋巴细胞的表面上并且触发 所述淋巴细胞的活化和/或增殖的内源蛋白质的胞内域（例如，细胞质域），和（iii)结合 于目标抗原的胞外域，其中，如果该跨膜域是来自CTLA4,则所述多肽的胞内域和胞外域不 是来自CTLA4 ;和如果该跨膜域是来自PD-1，则所述多肽的胞内域和胞外域不是来自Η)-1。 在一个具体的实施方式中，该多肽是嵌合抗原受体（CAR)。在一个具体的实施方式中，表达 本文描述的所述多肽或此类多肽的任何一种的T淋巴细胞当所述多肽结合于所述抗原时 经活化或刺激得以增殖。在一个具体的实施方式中，该多肽当表达于T淋巴细胞的表面上 时引导该T淋巴细胞将表达所述抗原的细胞杀死。
[0011] 在一个具体的实施方式中，本文提供的是多肽，其包含来自CTLA4的跨膜域，其中 该CTLA4跨膜域是由人ctla4基因（例如，GenBank登记号NM_005214. 4(CTLA4细胞毒性 T-淋巴细胞相关蛋白4(智人）；GeneID: 1493))的外显子3编码的多肽序列。
[0012] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序 列PEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，Pro-Glu-Pro-Cys-Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-P he-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Ser-Lys-Met)(SEQIDN0:l)〇
[0013] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含由 GenBank登记号NM_005214. 4 (CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4 (智人）；Gene ID: 1493)的核苷酸610-722编码的多肽序列。
[0014] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序 列PDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSL(以三字母密码，Pro-Asp-Ser-Asp-Phe-Leu-Leu-Trp -Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val-Ser-Leu)(SEQIDN0:2)〇
[0015] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含由 GenBank登记号NM_005214. 4 (CTLA4细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4 (智人）；Gene ID: 1493)的核苷酸636-699编码的多肽序列。
[0016] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含氨基酸序 列FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAV(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-S er-Ser-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr-Ala-Val)(SEQIDN0:3)〇
[0017] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLT(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Se r-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Leu-Thr)(SEQIDN0:4)〇
[0018] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列 FLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLS(以三字母密码，Phe-Leu-Leu-Trp-Ile-Leu-Val-Ala-Val -Ser-Leu-Gly-Leu-Phe-Phe-Tyr-Ser-Phe-Leu-Val-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Ser)(SEQID NO:5)〇
[0019] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列 LGIGNGTQIYVIDPEPSPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，LeuGlylie GlyAsnGlyThrGinlieTyrVallieAspProGluProSerProAspSerAspPheLeu LeuTrplieLeuAlaAlaValSerSerGlyLeuPhePheTyrSerPheLeuLeuThrAla ValSerLeuSerLysMet)(SEQIDNO:9)〇
[0020] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的CTLA4跨膜域是或包含多肽序列 FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKM(以三字母密码，PheLeuLeuTrplieLeuAlaAlaVal SerSerGlyLeuPhePheTyrSerPheLeuLeuThrAlaValSerLeuSerLysMet) (SEQIDN0:10)〇
[0021] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的ro-i跨膜域是或包含氨基酸序 列TLWGWGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(以三字母密码，Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Val-Gly -Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile-Cys-Ser-Arg-Ala-Ala)(SEQIDN0:6)〇
[0022] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的ro-i跨膜域是或包含氨基酸序 列VGWGGLLGSLVLLVWVLAVI(以三字母密码，Val-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser -Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQIDN0:7)〇
[0023] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的ro-i跨膜域是或包含氨基酸序 列FQTLWGWGGLLGSLVLLVWVLAVI(以三字母密码，Phe-Glu-Thr-Leu-Val-Val-Gly-Val-Va 1-Gly-Gly-Leu-Leu-Gly-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Val-Trp-Val-Leu-Ala-Val-Ile)(SEQID NO:8)〇
[0024] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽的ro-i跨膜域是或包含氨基酸序 列FQTLWGWGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAA(以三字母密码，PheGinThrLeuValValGlyVal ValGlyGlyLeuLeuGlySerLeuValLeuLeuValTrpValLeuAlaVallieCysSer ArgAlaAla)(SEQIDNO:11)。
[0025] 以本文描述的CTLA-4和PD-1 跨膜域序列（S卩，SEQIDN0:1,SEQIDN0:2,SEQID NO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQ IDNO: 10和SEQIDNO: 11)为范例举例说明，本文描述的跨膜域在某些实施方式中包含来 自它们所衍生的蛋白质（即，ctla-4或ro-i)的胞外域的一个或多个氨基酸和/或来自它 们所衍生的蛋白质（即，ctla-4或ro-i)的胞内域的一个或多个氨基酸。在某些实施方式 中，本文描述的跨膜域包含来自它们所衍生的蛋白质（即，ctla-4或ro-i)的胞外域的1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 个氨基酸。在 某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含来自它们所衍生的蛋白质（即，ctla-4或ro-i) 的胞内域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25 个氨基酸。在某些实施方式中，本文描述的跨膜域包含（i)来自它们所衍生的蛋白质（即， CTLA-4 或PD-1)的胞外域的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24或25个氨基酸和（^)来自它们所衍生的蛋白质（即，（：1'1^-4或1^-1)的胞 内域的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 个氨 基酸。
[0026] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的是多肽，其包含跨膜域，其中该跨膜域是 或包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10或SEQIDN0:11中所公开的至少 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸。在另一个具体的实施方式中，本 文提供的是多肽，其包含跨膜域，其中该跨膜域与SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、 SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQ IDNO: 10或SEQIDNO: 11有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同一 性。在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽在多肽的跨膜域中包含1、2、3、4或5个 氨基突变（aminomutations)，例如保守氨基酸突变（例如，疏水氨基酸突变成不同的疏水 氨基酸）。
[0027] 在某些实施方式中，本文提供的是核苷酸序列，其编码本文公开的多肽中的一种。 在一个具体的实施方式中，本文提供的是核苷酸序列，其包含编码SEQIDN0:1、SEQID NO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、 SEQIDN0:9、SEQIDNO: 10或SEQIDNO: 11中所公开的氨基酸序列中的任一种的核苷酸 序列。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是核酸，其编码本文描述的多肽，其中该核 酸包含编码SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQID N0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10或SEQIDN0:11中所公开 的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个连续氨基酸的核苷酸序列。在另一个 具体的实施方式中，本文提供的是核酸序列，其编码与SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQID NO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、 SEQIDNO: 10或SEQIDNO: 11有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% 同一1性的多肽。
[0028] 在某些实施方式中，任何本文描述的多肽的胞外域包含结合于抗原的受体或受体 部分。该胞外域可以是例如结合于所述抗原的受体或受体部分。在某些实施方式中，该胞 外域包含或是抗体或其抗原-结合部分。在一个具体的实施方式中，该胞外域包含或是单 链Fv域。该单链Fv域可包含例如通过柔性接头（flexiblelinker)与VH连接的Vp其中 所述\和VH是来自结合所述抗原的抗体。
[0029] 该多肽的胞外域所结合的抗原可以是任何目标抗原，例如肿瘤细胞上的抗原。该 肿瘤细胞可以是例如实体肿瘤中的细胞或非实体肿瘤的细胞，例如血液癌症的细胞。在某 些实施方式中，该抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一个具体的实施方式中，该 肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是（但不限于）Her2、前列腺干细胞抗原（PSCA)、甲胎蛋 白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、|丐视网膜蛋白（calretinin)、 MUC-1、上皮膜蛋白（EMA)、上皮肿瘤抗原（ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原（MAGE)、 CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、桥粒蛋白（desmin)、胶质细胞原纤维酸 性蛋白（GFAP)、巨囊性疾病液体蛋白（grosscysticdiseasefluidprotein,GCDFP-15)、 HMB-45抗原、蛋白melan-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-Dl、肌肉 特异性肌动蛋白（MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶（NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡 蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型（肿瘤 M2-PK)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、⑶2 (神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子变异 体III)、精子蛋白17 (Spl7)、间皮蛋白、PAP(前列腺酸性磷酸酶）、pr〇Stein、TARP(T细胞受 体γ可变阅读框架蛋白（Tcellreceptorgammaalternatereadingframeprotein))、Trp-p8、STEAPl(前列腺六次跨膜上皮 1 抗原（six-transmembraneepithelialantigen oftheprostate1))、异常ras蛋白或异常p53蛋白。在另一个具体的实施方式中，所 述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是整联蛋白av03(CD61)、催乳激素（galactin)、 K-Ras(V-Ki_ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因）或Ral_B。
[0030] 在某些实施方式中，本文描述的多肽的胞外域通过接头（linker)、间隔区 (spacer)或铰链区（hinge)多肽/肽序列（例如，CH2CH3铰链区序列或来自⑶8、⑶28、 ctla4或ro-i的序列）与该多肽的跨膜域相连接。
[0031] 在某些实施方式中，本文描述的多肽的胞内域是或包含表达于T细胞的表面上并 且触发所述T细胞的活化和/或增殖的蛋白质的胞内域。在一个具体的实施方式中，该胞 内域是⑶3ζ细胞内信号传导域（intracellularsignalingdomain)。在另一个具体的实 施方式中，该胞内域是来自淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合物蛋白、Fc受体亚基（subunit) 或IL-2受体亚基。
[0032] 在某些实施方式中，本文提供的多肽另外包含一个或多个共刺激域，例如，作 为该多肽的胞内域的一部分。该一个或多个共刺激域可以是或可以包含（但不限于） 共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激0X40(CD134)多肽序列、共刺激 4_1BB(CD137)多肽序列或共刺激可诱导T-细胞共刺激（IC0S)多肽序列中的一种或多种。
[0033] 在一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：（i)抗 原-结合域（例如，结合肿瘤细胞上的抗原（例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原）的抗原 结合域）；（ii)CD28或CTLA4铰链区多肽序列；（iii)CTLA4或ro-Ι跨膜域；（iv)共刺激域； 和（v)细胞内信号传导域。在一个具体的实施方式中，该多肽的抗原-结合域结合于CD19。
[0034] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：（i)抗 原-结合域（例如，结合肿瘤细胞上的抗原（例如，以上描述的肿瘤细胞上的抗原）的抗原 结合域）；（ii)CH2CH3铰链区多肽序列；（iii)CTLA4或ro-Ι跨膜域；（iv)⑶28共刺激域； 和（v)CD3G细胞内信号传导域。
[0035] 在另一个具体的实施方式中，本文提供的多肽从N-端到C-端按顺序包含：（i)抗 原-结合域（例如，结合肿瘤细胞上的抗原（例如，以上描述的肿瘤细胞