54] 引物DH-1F和引物DH-2R均为单链DNA分子。
[0055] 理论PCR扩增产物的长度为330bp。
[0056] 二、制备用于鉴定多花黄精的试剂盒
[0057] 用于鉴定多花黄精的试剂盒为将步骤一合成的引物DH-1F和引物DH-2R分别单独 包装后，与分别单独包装的10XPCR Buffer、Taq DNA polymerase、MgCl2(25mM)和dNTPs 等包装于同一个试剂盒中。
[0058] 三、鉴定待测样品中是否含有多花黄精的方法的建立
[0059] 采用步骤二的试剂盒鉴定待测样品中是否含有多花黄精，步骤如下：
[0060] 1、PCR扩增
[0061] 提取待测样品的基因组DNA并以其作为模板，采用步骤二的试剂盒进行PCR扩增 反应，获得PCR扩增产物。
[0062]反应体系：待测样品的基因组DNA100ng、10XPCRBuffer(Mg2+plus20πΜ) 2. 5μL、TaqDNA polymerase(2U/μL) 0· 4μL、dOTPs(lOmM) 0· 5μL、引物DH-1F和引物DH-2R各lOpmo1，用去离子水补 至 25μL。
[0063]反应程序：94°C5min;94°C45s，58°Clmin，共 35 个循环；72°C7min。
[0064] 2、PCR扩增产物检测
[0065] 采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物，具体如下：
[0066] 取5以1^?0?扩增产物，采用1.5%琼脂糖凝胶，在电压80-9(^下电泳3〇1^11，凝 胶成像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小进行结果判定：若PCR扩增产物中含有大 小约为330bp的目的条带（序列表的序列3)，则所述待测样本中含有或候选含有多花黄精； 若PCR扩增产物中不含有大小约为330bp的目的条带（序列表的序列3)，则所述待测样本 中不含有或候选不含有多花黄精。
[0067]实施例2、实施例1制备的用于鉴定多花黄精的试剂盒的特异性
[0068] 实验重复三次，每次重复的步骤如下：
[0069] 1、取约1-?待测样本（多花黄精（Polygonatumcyrtonema)、玉竹（Polygonatum odoratum(Mill. )Druce)、小黄精（PolygonatumuncinatumDiels)、苦黄精、马铃薯 (Solanum tuberosum)、红墓(Ipomoea batatas (L. ) Lam.)、山药(Dioscorea opposita Thunb.)、生姜(Zingiber officinale Roscoe)或芋头(Colocasia esculenta(L.) Schoot))的植物叶片或者块茎，用CTAB法提取基因组DNA进行电泳检测（实验结果见图 1，图1中泳道Μ为DNA分子标准，泳道1-9分别为多花黄精基因组DNA、以玉竹基因组DNA、 以小黄精基因组DNA、以苦黄精基因组DNA、以马铃薯基因组DNA、以红薯基因组DNA、以山药 基因组DNA、以生姜基因组DNA和以芋头基因组DNA)，待测样本的基因组DNA的浓度均在 30ng/ μ l_50ng/ μ 1之间。
[0070] 2、以步骤1提取的待测样本的基因组DNA为模板，以人工合成的psbA-trnH-F: 5' -GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3' 和psbA-trnH-R:5' -CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3' 为通 用引物，进行PCR扩增，检测待测样本的基因组DNA质量。
[0071] 反应总体系为25yL，包括待测样本的基因组DNA0· 5yL、10XPCRBuffer 2. 5yL、TaqDNApolymerase(5U/yL)0. 5yL、MgCl2(25mM)l. 5yL、dNTPs(10mM)0. 5yL、引 物psbA-trnH-F和psbA-trnH-R各lOpmol，用去离子水补至 25μL。
[0072]反应程序：94°C5min;94°Clmin，56°Clmin，72°Clmin，共 35 个循环，72°C7min。
[0073] 按照上述步骤，提取多花黄精基因组DNA，并将待测样本的基因组DNA替换为等体 积的多花黄精基因组DNA，其它步骤均不变，进行PCR扩增反应，作为阳性对照。
[0074] 按照上述步骤，将待测样本的基因组DNA替换为等体积的灭菌超纯水，其它步骤 均不变，进行PCR扩增反应，作为空白对照。
[0075] 实验结果见图2 (泳道Μ为DNA分子标准，泳道1-9分别为以多花黄精基因组DNA、 以玉竹基因组DNA、以小黄精基因组DNA、以苦黄精基因组DNA、以马铃薯基因组DNA、以红薯 基因组DNA、以山药基因组DNA、以生姜基因组DNA、以芋头基因组DNA和以灭菌超纯水为模 板），结果表明阳性对照和待测样本均能实现有效扩增，电泳显示含有大小约为330bp的目 的条带；空白对照不能实现有效扩增，电泳显示不含有大小约为330bp的目的条带。将大小 约为330bp的目的条带回收测序，其序列如序列表中序列3所示。可见待测样本的基因组 DNA质量均满足要求。
[0076] 3、以步骤1提取的待测样本的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一合成的引 物DH-1F和引物DH-2R组成的引物对，进行PCR扩增。具体的反应体系和反应程序同实施 例1步骤三1。实验同时设置以灭菌超纯水为模板的阴性对照。反应结束后，按照实施例1 步骤三2的方法对待测样本进行结果判定。
[0077] 实验结果见图3 (泳道Μ为DNA分子标准，泳道1-9分别为以多花黄精基因组DNA、 以玉竹基因组DNA、以小黄精基因组DNA、以苦黄精基因组DNA、以马铃薯基因组DNA、以红薯 基因组DNA、以山药基因组DNA、以生姜基因组DNA、以芋头基因组DNA和以灭菌超纯水为模 板）。结果表明，仅多花黄精能够扩增出大小约为330bp的目的条带。将大小约为330bp的 目的条带回收测序，其序列如序列表中序列3所示。这表明实施例1制备的用于鉴定多花 黄精的试剂盒能够准确鉴定多花黄精。
【主权项】
1. 用于鉴定多花黄精的引物对，由引物DH-1F和引物DH-2R组成，各条引物均为单链 DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。2. 权利要求1所述引物对的应用，为如下al)_a6)中任一种： al)制备用于检测或辅助检测多花黄精的试剂盒； a2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有多花黄精；a3)制备用于鉴定或辅助鉴定多花黄精的试剂盒； a4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精； a5)制备用于鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性的试剂盒； a6)鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性。3. 含有权利要求1所述引物对的试剂盒；所述试剂盒用于鉴定多花黄精。4. 权利要求3所述的试剂盒的制备方法，包括将权利要求1中所述引物DH-1F和所述 引物DH-2R分别单独包装的步骤。5. 权利要求3所述试剂盒的应用，为如下bl)或b2)或b3): bl)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有多花黄精； b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精； b3)鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性。6. -种检测待测样品是否含有或候选含有多花黄精的方法，包括如下步骤： 提取待测样品的总DNA，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果能够实现有效 扩增，则所述待测样品中含有或候选含有多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所述待测样 品中不含有或候选不含有多花黄精。7. -种鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精的方法，包括如下步骤： 提取待测样品的基因组DNA，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果能够实现 有效扩增，则所述待测样品为或候选为多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品 不为或候选不为多花黄精。8. 如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述待测样品为中药材，或，所述中药 材的基源植物，或，取自所述中药材的基源植物的组织或器官。9. 一种鉴定市售多花黄精的真伪性的方法，包括如下步骤： 提取市售多花黄精的基因组DNA，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，如果能够 实现有效扩增，则所述市售多花黄精为或候选为真品；如果不能实现有效扩增，则所述市售 多花黄精为或候选为伪品。10. 如权利要求6至9任一所述的方法，其特征在于： 所述"能够实现有效扩增"为PCR扩增产物中含有300-400bp的DNA片段； 所述"不能实现有效扩增"为PCR扩增产物中不含有300-400bp的DNA片段。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对。本发明所提供的引物对，由引物DH-1F和引物DH-2R组成，引物DH-1F和引物DH-2R均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1和序列2。利用引物DH-1F和引物DH-2R对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有多花黄精。实验证明，利用本发明提供的鉴定多花黄精的方法能够快捷而简便的鉴定多花黄精，以保障多花黄精临床用药的安全，具有重大的推广前景和应用价值。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105274245
【申请号】CN201510817723
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 季鹏章, 赵玉洋
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月23日