% C02的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加 入经灭菌处理的化合物5与含0. 1 % DMS0的培养基配制成的溶液，每孔25 μ L，对照组加入 等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25 μ L浓度为5mg/mL的ΜΤΤ溶液， 置于37°C和5% C02的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100 μ L的 DMS0,振荡约lOmin溶解紫色残留物（甲瓒），立即于酶标仪上检测0· D.(吸光度）值，波长 为 570nm。
[0060] 悬浮细胞HL60的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5X 104个 /mL的密度接种于96孔板，每孔100 μ L，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物 5与含0. 1% DMS0的培养基配制成的溶液，每孔25 μ L，对照组加入等体积的溶解样品的溶 媒，置于37°C和5% C02的细胞孵育箱中培养48小时。每孔加入25 μ L浓度为5mg/mL的 MTT溶液，继续置于条件为37°C和5% C02的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min， 小心吸出上清液，每孔加入lOOyLDMSO,振荡约lOmin溶解紫色残留物（甲瓒），立即于酶 标仪上检测〇· D.(吸光度）值，波长为570nm。
[0061] 按下式求出各个浓度下化合物5抑制肿瘤细胞增殖的活性：
[0062] 细胞增殖（％ )=(化合物5组平均0· D.值/对照组平均0· D.值）X 100 %，实 验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出ICS。（半数有效抑制浓度）值。
[0063] 4)结果见图4。结果表明，
[0064] 在体外细胞毒试验中，评价了化合物5仅在100和200 μ Μ的高浓度对Bel-7402， Η印G2, HL60, HT-29, HeLa，S180, A549和HCCLM3等8株肿瘤细胞显示弱的细胞毒作用。
[0065] 实验例3评价化合物5的体内抗肿瘤活性
[0066] 1)本发明的化合物5含吐温80的生理盐水溶解，阿霉素用生理盐水溶解作为阳性 对照，含吐温80的生理盐水作为阴性对照；
[0067] 2)化合物5和含吐温80的生理盐水均灌胃给药，化合物5的给药剂量为lOnmol/ kg，含吐温80的生理盐水的给药剂量为0. 2mL/20g，连续给药7天，共给药7次；阿霉素腹 腔给药，给药剂量为2 μ mol/kg，连续给药7天，共给药7次。
[0068] 3)实验动物为ICR雄性小鼠（清洁级），体重20 ± 2g，每组12只小鼠。
[0069] 4)瘤源为小鼠 S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。
[0070] 5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐 水稀释成（1 : 2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2%台盼蓝染色，混匀 后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞 浓度和细胞存活率。
[0071] 细胞浓度=4大方格内活细胞数/4X 104X稀释倍数=细胞数/mL
[0072] 细胞存活率=活细胞数八活细胞数+死细胞数）X 100%
[0073] 将存活率大于90%的瘤液用匀浆法制备成2. OX 107个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮 下接种，0. 2mL/只，制造 S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日口服化合物5， 剂量为10nm〇l/kg。空白组小鼠每日口服0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每 日腹腔注射阿霉素，剂量为2 μ mol/kg。实验进行至第8天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎 处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重， 按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％ =(阴性对照组平均瘤重-化合物5组平均瘤重）/阴性 对照组平均瘤重X 100%。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以([土SDg):表示。结果 见表1。由表1可以看出，在10nm0l/kg的口服剂量下，化合物5治疗组小鼠的瘤重与生理 盐水组相比具显著性差异，与阿霉素组相比没有显著性差异。可见，化合物5的有效剂量比 阿霉素低200倍。
[0074] 表1化合物5的体内抗肿瘤活性
[0076] η = 12 ;a)与生理盐水组比p < 0· 01，与阿霉素组比p > 0· 05。
[0077] 实验例4评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞粘附活性
[0078] 1)化合物3和5用含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制成浓度为100nM的溶液。
[0079] 2)细胞为HCCLM3 (高转移人肝癌细胞）。
[0080] 3) Fn (人纤维连接蛋白）。
[0081] 4)实验方法
[0082] 用PBS将Fn配制成浓度为100 μ g/mL的溶液，按100 μ L/孔加入96孔培养板中， 将培养板置于4°C冰箱过夜。次日，吸除未包被Fn溶液，用PBS洗1次，每孔加入含2 % FBS 的PBS溶液30 μ L封板，在37°C和5% C02的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长 状态良好、处于对数生长期的HCCLM3细胞以5 X 104个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板 中，每孔100 μ L，同时加入25 μ L化合物3或5的溶液，使其终浓度为20nM，在37°C和5 % C〇2培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25 μ L浓度为5mg/ mL的MTT溶液，置于37°C和5% C02培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入 100 μ L DMS0,振荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测0. D.(吸光度）值。 粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率（％) = [1-(化合物5组细胞的0D值/空白组 细胞的0D值）]X 100% ;实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以均值土SD 表7K。
[0083] 5)结果见表2。由表2可以看出，化合物5在20nM浓度下明显抑制HCCLM3细胞 与FN粘附，粘附抑制率为24. 2%。与LPNISKP抑制SACC-LM细胞与ECM及血小板粘附的有 效浓度为1 μ Μ相比，化合物5的有效浓度降低了 50倍。
[0084] 表2化合物5的体外抗肿瘤细胞粘附活性
[0087] 实验例5评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
[0088] 1)化合物3和5用含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制成浓度为ΙΟΟηΜ的溶液。
[0089] 2)细胞为HCCLM3 (高转移人肝癌细胞）。
[0090] 3)基质胶为 matrigel。
[0091] 4)实验方法
[0092] 将冻存于-20°C冰箱的基质胶matrigel4°C过夜，变成液态；取720 μ L无血清 DMEM培养基，加入180yL Matr i ge 1，混匀，加入至Transwe 11小室的聚碳酸酯膜上室， 100μ L/个，放入37°C和5% C02培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μ L DMEM培养基，37°C和5% C02培养箱中孵育30min。
[0093] HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为 5 X 105个/mL。每孔加入100 μ L细胞悬液，同时加入25 μ L同时加入25 μ L化合物3或5 的溶液，使其终浓度为20ηΜ。空白对照加25 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制的溶液。 下室加入600 μ L无血清DMEM培养基，在37°C和5% C02培养箱中培养48小时。
[0094] 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4%的多聚甲醛固定细胞30min。吸除 固定液，用PBS洗3次，用0. 1 %的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0095] 在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检 验和方差分析，侵袭的细胞数以均值土SD表示。
[0096] 5)结果见表3。可以看出，在20nM浓度下化合物3与空白对照组相比，发生侵袭 的细胞数显著减少，说明在该条件下化合物3具有明显的抗HCCLM3细胞侵袭作用。还可以 看出，在20nM浓度下化合物5与化合物3相比，发生侵袭的细胞数也显著减少，说明在该条 件下化合物5抗HCCLM3细胞侵袭作用明显比化合物3强。与LDV抑制SACC-LM细胞侵袭 的有效浓度为1 μ Μ相比，化合物5的有效浓度降低了 50倍。
[0097] 表3化合物5的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
[0099] η = 9 ;a)与空白对照组和化合物3组比ρ < 0· 01 ;b)与空白对照组比ρ < 0· 01。
[0100] 实验例6评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞迁移活性
[0101] 1)化合物3和5用含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制成浓度为ΙΟΟηΜ的溶液。
[0102] 2)细胞为HCCLM3 (高转移人肝癌细胞）。
[0103] 3)实验方法
[0104] HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为 2 X 106个/mL。每孔加入100 μ L细胞悬液，同时加入25 μ L同时加入25 μ L化合物3或5 的溶液，使其终浓度为20ηΜ。空白对照加25 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制的溶液。 下室加入600 μ L无血清DMHM培养基，在37°C和5% C02培养箱中培养6小时。
[0105] 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4%的多聚甲醛固定细胞30min。吸除 固定液，用PBS洗3次，用0. 1 %的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0106] 在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检 验和方差分析，侵袭的细胞数以均值土SD表示。
[0107] 4)结果见表4。可以看出，在20nM浓度下化合物3与空白对照组相比，发生侵袭 的细胞数显著减少，说明在该条件下化合物3具有明显的抗HCCLM3细胞侵袭作用。还可以 看出，在20nM浓度下化合物5与化合物3相比，发生侵袭的细胞数也显著减少，说明在该条 件下化合物5抗HCCLM3细胞侵袭作用明显比化合物3强。与LDV抑制SACC-LM细胞侵袭 的有效浓度为1 μ Μ相比，化合物5的有效浓度降低了 50倍。
[0108] 表4化合物5的体外抗肿瘤细胞迁移活性
[0110] η = 9 ;a)与空白对照组和化合物3组比ρ < 0· 01。
[0111] 实验例7评价化合物5的体内抗炎活性
[0112] 1)实验方法
[0113] 18_22g