(Invitrogen)，获得pcDNA3-T7。通过测序验证所述片段在 载体PCDNA3-T7中的存在。 邮14] 通过伸用化于T7启动子梓制下的内部核糖体讲入仿点产牛表武加强巧绿传巧 化帝白的质粒
[021引为了测试T7聚合酶的功能性，使用质粒祀GFP-N1 (Clontech，Califo;rnia，USA)和 下述引物对通过PCR扩增加强型绿色巧光蛋白巧GFP)的开放阅读框：
[0216]EGFP-FP(CCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG)沈QIDNO:50 和
[0217]EGFP-RP(CCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG)SEQIDNO:51。
[0218] 凝胶洗脱所获得的PCR片段，将其与限制性内切酶BamHI和No11 -起溫育。 凝胶洗脱反应产物，将其连接至适当切割的载体pUTE4A(Novagen)中。将获得的质 粒（pCITE4A-EGFP)用于随后的实验。使用Lipofectin2000 (Invitrogen)将质粒 PCITE4A-EGFP和PCDNA3-T7单独或组合地转染入生长在24孔板中的鸡细胞系DFl中。转 染后24小时，除去培养基，加入无菌憐酸盐缓冲盐水（PBS)。使用倒置巧光显微镜Axioved 40CFUZeiss，Jena,Germany)评估细胞。只在用两种质粒共转染的组织培养板的孔中观察 到绿色巧光。该结果显示两种质粒p(HTE4A-EGFP和PCDNA3-T7都具有功能。 邮1引 伸用微小基闲紀质粒輪证表武的病毒帝白NP、P巧L的功能忡
[0220]用pcDNA3-T7、pUC18-MG-APMV-8、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染DF1 细胞 W验证表达的NP、P和L蛋白的功能性。转染后24小时，除去培养基，加入无菌憐酸盐缓冲 盐水（PBS)。使用倒置巧光显微镜Axioved40CFUZeiss，Jena,Germany)评估细胞。只 在用5种质粒共转染的组织培养板的孔中观察到绿色巧光。该结果表明，表达的病毒蛋白 NP、P和L有功能将APMV-8微小基因组转录成mRNA和表达由PUC18-MG-APMV-8编码的EGFP 蛋白。 阳2引] 从巧含APMV-8的仓长序列的质粒巧救AMPV8病毒
[022引 用加C57-化-APMV-8、pcDNA-NP、pcDNA-P巧pcDNA-L共转染DF1 细胸。在 48 至 96小时后，在10日龄的含胚蛋中接种DF1细胞的上清液W扩增病毒。在3至5天后，收获 尿囊液，使用1 %的鸡红细胞测试其血凝集活性（HA)。将对于HA活性测试为阳性的尿囊液 用于3个操作。1)用尿囊液感染DF1细胞，并且在用APMV-8特异性抗血清感染后36小时 在间接免疫巧光测定中测试其中APMV-8蛋白表达的存在情况。2)利用血凝集抑制测定，使 用APMV-8特异性鸡血清（由化tionalCentralVeterinaryL油oratory,Ames,Iowa,USA 提供）测试尿囊液的APMV-8特异性。3)使用APMV-8特异性寡核巧酸通过RT-PCR鉴定捶 救病毒。通过在反应过程中省略RT步骤来验证病毒cDNA的不存在。在含胚SPF鸡蛋中进 一步扩增在所有3个测定中测试为阳性的样品，
[022引 在鸡夹源外的细胸中扩蜡APMV-8
[0224] 将来自不同物种[仓鼠（幼仓鼠肾细胞，BHK-21细胞）、猴（Vero细胞，具有非洲 绿猴的肾来源的细胞系）化及犬科动物（马-达二氏犬肾细胞，MDCK)和鹤譜（鹤譜肌细 胞系QM7)]的细胞培养在24孔组织培养板中，用0.01的感染复数感染所述细胞。感染后 24小时用冰冷的乙醇固定细胞，使用来自APMV-8感染的SPF鸡的APMV-8特异性抗血清通 过间接免疫巧光分析其中APMV-8特异性蛋白的存在情况。通过使用山羊抗鸡I巧特异性 FITC缀合物使抗体的结合可见。未感染的细胞用作阴性对照。只在APMV-8感染的细胞中 观察到绿色巧光。运表明APMV-8能够感染除鸡外的物种的细胞。
[0225] 在膜蛋白酶存在的情况下APMV-8的复制增加。如上所述用APMV-8感染MDCK细 胞。感染后，用无血清培养基漂洗细胞，用浓度为lug/ml的含膜蛋白酶无血清培养基或只 用无血清培养基覆盖细胞。感染后24、48和96小时后，除去细胞上清液，如上所述使用间 接免疫巧光法测定DF1细胞上的TCID50。获得的数据表明，与膜蛋白酶不存在的情况下相 比较，在该酶存在的情况下，APMV-8复制至更高的滴度（图19B)。
[0226] 该实施例的结果显示，与AMPV-1 -样，APMV-8能够渗入不同物种的细胞并且起始 其复制循环。因而其是用于多个物种的合适载体。 阳227] 伸用巧向遗传学体系产牛表武外源基闲的電紀APMV-8病毒
[022引为了产生表达高致病性禽流感（HPAI)的血凝素（HA)基因的重组APMV-8病毒（病 毒载体），将册或H7亚型病毒HPAI的HA基因的编码序列插入包含全长APMV-8基因组的 质粒中APMV-8基因组的非必需区域内，例如Μ与F基因之间或P与Μ基因之间。为此，血凝 素开放阅读框的编码序列侧翼连接F基因的所有必需调控序列，包括基因起始序列、5'非 编码序列、3'非编码序列和基因终止序列，W因其在质粒构建体中的唯一性而将限制性内 切酶切割位点Bsu361和化eI用于将适当的片段连接入包含全长APMV-8基因组的现有质 粒的方式来合成构建体。所得的质粒称为转录质粒，其在全长APMV-8基因组的非必需区域 中包含血凝素基因。通过使用该方法，可将多种病毒和细菌抗原的编码序列克隆入APMV-8 序列的主链。可被插入APMV-8基因组的其它可能的抗原是新城疫病毒的融合蛋白、禽支气 管炎病毒的S蛋白、来自非H5和非H7禽流感病毒的其它血凝素基因、鸡贫血病毒结构蛋白 基因VP1、来自传染性喉气管炎病毒的糖蛋白基因。
[0229] 实施例7动物的接种
[0230] 通过包含如实施例6中所述的重组APMV-8病毒（病毒载体）的组合物或疫苗的 1次、2次施用或初免-加强方案接种动物。对于鸡/鸟类，进行多次施用，例如在D18或 D19时进行卵内施用，在1日龄时进行皮下（SC)施用或在不同年龄进行粘膜施用（喷雾剂、 饮用水、滴眼剂）。剂量为3至7个loglO(优选4-6个logl0EID50)。对于哺乳动物，使用 粘膜途径（鼻内、眼内、口服）或胃肠外（IM、SC、无针、经皮肤或皮肤内）途径。剂量为5至 91og(优选6-81og)。通常W3-4周的间隔进行两次施用。异源初免-加强（例如，使用蛋 白质的加强）也可W是有利的。
[0231] 针对动物中抗特定抗原攻击评估由组合物或疫苗诱导的保护性效力。通过临床观 察和/或组织、血液或粘膜拭子中特定病原体的病毒载量来评估保护性作用。在不同时期 从接种的动物采集血液样品，测试其血清学。结果显示，本发明的组合物或疫苗具有免疫原 性，并且在接种的动物中提供保护作用。
[0232] 本发明设及W下实施方式：
[0233] 1. 一种组合物或疫苗，其包含（i)重组APMV病毒载体和（ii)药用或兽医学上可 接受的载体。
[0234] 2.实施方式1的组合物或疫苗，其中所述APMV为APMV-8、APMV-2、APMV-4或 APMV-6〇
[0235] 3.实施方式1或2的组合物或疫苗，其中所述APMV病毒载体包含与具有SEQID NO: 1中所示序列的多核巧酸具有至少90 %序列同一性的多核巧酸，或与同具有SEQID NO: 1中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多核巧酸互补的多核巧酸。
[0236] 4.实施方式1-3中任一项的组合物或疫苗，其中所述APMV病毒载体还包含编码抗 原的分离的多核巧酸，并且其中所述多核巧酸被插入在APMV基因组的非必需区域内。
[0237] 5.实施方式3的组合物或疫苗，其中所述非必需区域选自下述区域：位于NP开放 阅读框上游的非翻译区、APMV基因组的两个开放阅读框之间的基因间区域和位于L开放阅 读框下游的非翻译区。
[023引6.用于产生重组APMV病毒载体的方法，其中所述方法包括将分离的多核巧酸在APMV基因组的非必需区域内引入所述APMV基因组。
[0239] 7.实施方式6的方法，其中所述APMV为APMV-8、APMV-2、APMV-4 或APMV-6。
[0240]8.实施方式6或7的方法，其中所述APMV包含与具有SEQIDNO: 1中所示序列的 多核巧酸具有至少90%序列同一性的多核巧酸，或与同具有SEQIDNO: 1中所示序列的多 核巧酸具有至少90%序列同一性的多核巧酸互补的多核巧酸。
[0241] 9.实施方式6至8中任一项的方法，其中所述非必需区域选自下述区域：位于NP 开放阅读框上游的非翻译区、APMV基因组的两个开放阅读框之间的基因间区域和位于L开 放阅读框下游的非翻译区。
[0242] 10.实施方式6-9中任一项的方法，其中所述方法包括步骤：
[024引a)制备表达NP、P和L基因的表达质粒；
[0244]b)制备在全长APMV基因组的非必需区域中包含分离的多核巧酸的转录质粒；
[0245] C)将所述表达质粒和转录质粒转染入宿主细胞；
[0246]d)从所述宿主细胞捶救/回收感染性APMV病毒。
[0247] 11.实施方式6-9中任一项的方法，其中所述方法包括步骤：
[024引a)制备表达NP、P和L基因的表达质粒；
[0249]b)制备在全长APMV基因组的非必需区域中包含分离的多核巧酸的转录质粒；
[0巧0] C)制备表达T7聚合酶的表达质粒；
[0巧1] d)将所述表达质粒和转录质粒转染入宿主细胞；
[0252]e)从所述宿主细胞捶救/回收感染性APMV病毒。
[0253] 12.用于在动物中诱导针对抗原的免疫反应的方法，包括用包含重组APMV病毒载 体的组合物或疫苗接种所述动物，其中所述重组APMV病毒载体包含和表达所述动物的病 原体的抗原。
[0254] 13.实施方式12的方法，其中W初免-加强方案诱导动物的对所述抗原的免疫反 应。
[0巧5] 14.实施方式12的方法，其中所述动物是禽类、马科动物、犬科动物、猫科动物、猪 类、牛类、羊类或人。
[0巧6] 15.包含选自下列序列的多核巧酸的未修饰或经修饰的APMV病毒：
[0巧7] a)与具有SEQIDNO: 1中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多核 巧酸，或与同具有SEQIDN0:1中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多核巧 酸互补的多核巧酸；
[0巧引 b)与编码具有SEQIDN0:3中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与具有SEQIDN0:2中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的 多核巧酸，或与同具有SEQIDN0:2中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸互补的多核巧酸；
[0巧9] C)与编码具有SEQIDN0:5中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与具有SEQIDN0:4中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的 多核巧酸，或与同具有SEQIDN0:4中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸互补的多核巧酸；
[0260]d)与编码具有SEQIDN0:7中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与具有SEQIDN0:6中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的 多核巧酸，或与同具有SEQIDN0:6中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸互补的多核巧酸；
[026。e)与编码具有SEQIDN0:9中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与具有SEQIDN0:8中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的 多核巧酸，或与同具有SEQIDNO:8中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸互补的多核巧酸；
[026引f)与编码具有SEQIDNO: 11中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与具有SEQIDNO: 10中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的 多核巧酸，或与同具有SEQIDNO: 10中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸互补的多核巧酸；和
[026引 g)与编码具有SEQIDNO: 13中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与编码具有SEQIDNO: 14中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序 列同一性的多核巧酸，与具有SEQIDNO: 12中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一 性的多核巧酸，或与同具有SEQIDNO: 12中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性 的多核巧酸互补的多核巧酸。
[0264] 16.实施方式15的经修饰的APMV病毒，其还包含插入在APMV基因组的非必需区 域中的分离的多核巧酸。
[026引17. -种分离的多核巧酸，其选自：
[0266] a)与具有SEQIDNO: 1中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多核 巧酸，或与同具有SEQIDN0:1中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多核巧 酸互补的多核巧酸；
[0267] b)与编码具有SEQIDN0:3中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与具有SEQIDN0:2中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的 多核巧酸，或与同具有SEQIDN0:2中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸互补的多核巧酸；
[026引 C)与编码具有SEQIDN0:5所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同一 性的多核巧酸，与具有SEQIDN0:4中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸，或与同具有SEQIDN0:4中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多核 巧酸互补的多核巧酸；
[0269] d)与编码具有SEQIDN0:7中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与具有SEQIDN0:6中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的 多核巧酸，或与同具有SEQIDN0:6中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸互补的多核巧酸；
[0270] e)与编码具有SEQIDN0:9中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与具有SEQIDN0:8中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的 多核巧酸，或与同具有SEQIDN0:8中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸互补的多核巧酸；
[027。f)与编码具有SEQIDNO: 11所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同一 性的多核巧酸，与具有SEQIDNO: 10中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多 核巧酸，或与同具有SEQIDNO: 10中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性的多核 巧酸互补的多核巧酸；和
[027引g)与编码具有SEQIDNO: 13中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序列同 一性的多核巧酸，与编码具有SEQIDNO: 14中所示序列的多肤的多核巧酸具有至少90%序 列同一性的多核巧酸，与具有SEQIDNO: 12中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一 性的多核巧酸，或与同具有SEQIDNO: 12中所示序列的多核巧酸具有至少90%序列同一性 的多核巧酸互补的多核巧酸。
[0273] *林
[0274] 在已如此详细地描述本发明的优选实施方案后，应理解由上述段藩定义的本发明 不限定于上述描述所示的具体内容，因为其许多明显的变型是可能的，而不背离本发明的 精神或范围。
[0275] 本文中引用或参考的所有文献（"本文中引用的文献"）和引用的文献中引用和参 考的所有文献与本文中或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商 说明书、描述、产品说明书W及产品手册（productsheet)通过引用并入本文，并且可用于 本发明的实施，
[0276] 参考资料：
[0277] 1.Alexander, 1988.Newcastledisease,p.x, 378p.InD.J.Alexander(ed.), Developmentsinveterinaryvirology.KluwerAcademic，Boston.
[0278] 2.Alexander，Characterizationofviruseswhichrepresentfurther distinctserotypes(PMV-8andPMV-9)ofavianparamyxoviruses.ArchVirol 78:29-36.
[0279] 3.Alexander，etal.，1979.Propertiesofanewlyisolated，serologically distinctavianparamyxovirus.ArchVirol60:105-13.
[0280] 4.Alexander，2003.NewcastleDisease，otherParamyxoviruses，and PneumovirusAvianParamyxoviruses2-9，p. 63-99.InY.M.Saif(ed.)，Diseasesof poultry，11thed.IowaStatePress，Ames，Iowa.
[0281] 5.Andral，etal.，1984.Isolationofavianparamyxovirus2and3from turkeysinBrittany.Vet民ec114:570-1.
[0282] 6.Bankowski，etal.，1981，Effectofparamyxovirusyucaipaonfertility， hatchability，andpoultyieldofturkeys.AvianDis25:517-20.
[0283] 7.Bankowski，etal.，1960.IsolationofanUnidentifiedAgentfromthe 民espiratoryTractofChickens.Science132:292-293.
[0284] 8.Bradshaw,etal.，1979.TheEpidemiologyofYucaipaVirusin RelationshiptotheAcute民espiratoryDiseaseSyndromeinTurkeys.Avian Diseases23:539-542.
[0285] 9.Capua，etal.，2004.Isolationofanavianparamyxovirustype9from migratorywaterfowlinItaly.Vet民ec155:156.
[0286] 10.Chambers，etal.，1988.Protectionofchickensfromlethalinfluenza infectionbyvaccineexpressedhemagglutinin.Virology167:414 421.
[0287] 11.Collins，？.L.，etal.，1991.民escueofsyntheticanalogsofrespiratory syncytialvirusgenomicRNAandeffectoftruncationsandmutationsonthe expressionofaforeignreportergene.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9663-9667
[028引12.Conzelmann邸，andSchnellΜ.，1994.Rescueofsyn化eticgenomicRNA analogsofrabiesvirusbyplasmid-encodedproteins.JVirol. 68:713-719
[0289] 13.Dartei1，R.，M.Bublot，E.Laplace，J.F.Bouquet，J.C.Audonnetand M.民iviere(1995).Herpesvirusofturkeyrecombinantvirusesexpressing infectiousbursaldiseasevirus(IBDV)VP2immunogeninduceprotectionagainstan IBDVvirulentchallengeinchickens.Virology211,481490.
[0290] 14.deLeeuw，etal.，1999.CompletenucleotidesequenceofNewcastle diseasevirus:evidencefortheexistenceofanewgenuswithinthesubfamily Paramyxovirinae.JGenVirol80:131-136.
[0291] 15.Fleury，etal.，1979.Isolationoftwenty-threeYucaipa-likeviruses from616wildbirdsinSenegal，WestAfrica.AvianDis23:742-4.
[029引16.Gao，etal.，（2006) ·Protectionofmiceandpoultryfromle化al服N1 avianinfluenzavirusthroughadenovirus-basedimmunization.JVirol80:1959 1964.
[029引17.Ge，etal.，（2007)Newcastlediseasevirus-basedliveattenuated vaccinecompletelyprotectschickensandmicefromlethalchallengeof homologousandheterologousH5N1avianinfluenzaviruses.JournalofVirology， 81 (1),150-158.
[0294] 18.Goodman，etal.，1988.Isolationofavianparamyxovirus-2from domesticandwildbirdsinCosta民ica.AvianDis32:713-7.
[0295] 19.Gough，etal.，1984.Avianparamyxovirustype4isolatedfromaringed teal(Calonettaleucophrys).Vet民ec115:653.