溶解。使用比色法微 板读取器测量550nm和680nm(分别对应于甲廳盐和参照波长）下的吸光度。使用仅含完 全培养基的孔作为对照。每个实验进行两次，每个药物浓度使用6次重复。
[0149] 结果
[0150] 假设被Psap肽上调的Tsp-Ι可直接作用于癌细胞，而不是仅通过间接的抗血管发 生机制。为了测试这个假设，用重组Tsp-Ι或DWLPK(SEQ ID NO :2)Psap肽处理LLC细胞， 并且使用MTT测定测量细胞增殖。发现Tsp-1能够降低细胞增殖，而Psap肽不影响细胞增 殖（图1A)。这支持了 Tsp-Ι可直接作用于癌细胞的假设，因为该测定是在不存在任何血 管的情况下体外进行的。这些结果还表明，单独Psap肽不表现出对癌细胞增殖的影响，支 持了 Psap肽可通过上调Tsp-Ι间接治疗癌症的假设。示出LLC细胞表达⑶36 (Tsp-Ι的受 体），表明Tsp-Ι可通过⑶36直接作用于癌细胞（图1B)。
[0151] 在另一些细胞系中测量⑶36水平，以观察另外的癌症类型是否也表达⑶36。通 过western印迹分析测量乳腺癌（MDA-23UMCF-7)、卵巢癌（ID8)、黑素瘤（B16)、前列腺癌 (PC3和LNCaP)以及肺癌（LLC)细胞系中的CD36水平。发现在所有测试细胞系中均可检 测到⑶36蛋白，其中在MDA-231、MCF-7、PC3和LLC细胞系中可检测到特别高的⑶36水平 (图2)。之前已示出MDA-231、ID8、B16、PC3和LLC细胞响应于体内Psap肽治疗。
[0152] 还检查了胰腺细胞系AsPc1，并且发现其表达⑶36。
[0153] 还在来源于具有腹水之患者的原发性卵巢癌细胞中测量了CD36水平。在所有测 试的原发性卵巢癌细胞中均可检测到CD36蛋白（图3)。
[0154] 实施例2
[0155] 方法
[0156] 小鼠和细胞系
[0157] 所有动物工作根据InstitutionalAnimalCareandUseCommittee批准的方案 进行。野生型C57BL/6J和GFP转基因C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)lOsb/J获自TheJackson Laboratory(BarHarbor，Maine) 〇CB-17SCID小鼠获自CharlesRiver(Wilmington，MA) 〇
[0158] 先前描述了细胞系PC3和PC3M-LN4(14)。先前描述了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 和MDA-MB-LM2(Ryu等PLoSone，6,2011)。将稳定表达RFP和萤火虫萤光素酶的鼠Lewis 肺癌细胞系 LLCs/D122(由 Lea Eisenbach 提供，Wiesmann Institute of Science，Rehovot，Israel)培养在补充有 10%胎牛血清的 DMEM 中（Gupta GP，Massague J. Cancer metastasis ：building a framework. Cell. 2006 ；127 :679-95 ；Gao D，Nolan DJ，Mellick AS，Bambino K，McDonnell K，Mittal V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 2008 ;319 :195-8 ;以及 Joyce JA,Pollard Jff. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 2009； 9 :239-52)。
[0159] 组织微阵列和免疫组织化学
[0160] 从DepartmentofPathology,TheGadeInstitute，HaukelandUniversity Hospital的文件中取得存档试样（前列腺根除术试样或转移瘤的活检物）。将福尔马林固 定的前列腺切除术试样用石蜡包埋并且以5_间隔的整体封片步骤进行研究。在每种情况 下，从最高肿瘤级别的区域选择三个组织核心（〇.6_直径）构建组织微阵列（TMA)。
[0161] 将来自TMA石蜡块的薄石蜡切片（5 μm)用二甲苯/乙醇脱錯，然后在柠檬酸盐缓 冲液（pH6. 0)中进行热诱导的微波表位恢复20分钟，与CD36抗体在室温下孵育60分钟。 用EnVision链聚合物方法（DakoCytomation，Copenhagen，Denmark)作为检测系统在DAK0 自动染色机上进行免疫染色。使用DAB二氨基联苯胺过氧化物酶反应用苏木精复染实现抗 原定位。
[0162] 半定量地估计免疫染色，并且计算作为染色强度（0-3)与免疫阳性肿瘤细胞的比 例（< 10%= 1，10-50%= 2, > 50%= 3)的乘积获得的染色指数（SI)。染色指数（范围 0-9)是分类量表，其中预期了每个类别中的一些变化。
[0163] 肿瘤细胞中⑶36的敲减
[0164] 使用编码靶向CD36的miRNA或shRNA的逆转录病毒或慢病毒载体使癌细胞系 中的⑶36水平降低。使用qPCR分析测试敲减效率。使用PicoPureRNA提取试剂盒 (Arcturus)根据制造商的方案进行总RNA的提取。使用qScript?cDNAsupermix(Quanta biosciences)将RNA转化成cDNA。用引物和iQTMSYBERGreenmastermix(Biorad， Hercule，CA)进行qPCR。在偶联有Bio-Rad-CFXManager软件的BioRadCFX96RealTime System(BioRad)上进行以下标准方案：初始变性95°C10分钟，95°C10秒、60°C30秒和 72Γ30秒40个循环，然后是72°C5分钟的最终延伸，并且进行溶解曲线分析。使用Δ-Ct 法计算每一转录物与对照相比的相对丰度。
[0165] 体外细胞增殖测定
[0166] 使用MTT(3- {4, 5-二甲基噻唑-2-基} -2, 5-二苯基四唑溴盐，Sigma-Aldrich)测 定测量细胞增殖。将细胞接种到96孔培养板中的50μL生长培养基中，并且允许附着过夜。 然后添加50μL生长培养基以及二倍浓度的处理试剂。在每个处理时间点之后，向每个孔 添加10μL的5%ΜΤΤ溶液（在PBS中缓冲）。将板在37°C下再孵育4小时以使得ΜΤΤ在 细胞线粒体中代谢转化成甲1習晶体。通过向每个微板的孔添加100μ150%N-N-二甲基甲 酰胺中的10%十二烷基硫酸钠来使所述甲I習晶体最终溶解。使用比色法微板读取器测量 550nm和680nm(分别对应于甲腦盐和参照波长）下的吸光度。使用仅含完全培养基的孔 作为对照。每个实验进行两次，每个药物浓度使用6次重复。
[0167] 转移瘤测定、生物法光成像和分析
[0168] 对于实验的转移瘤，通过尾静脉向7周大的C57BL/6小鼠注射1X105萤光素 酶标记的LLC细胞。对于原位乳腺癌细胞注射，将5X106MDA-MB-231或其转移瘤变体 MDA-MB-LM2细胞以0.lml的体积注射到CB-17SCID小鼠脂肪垫中。每周一次通过活动物 生物发光成像（Xenogen)监测肿瘤生长和肺转移瘤（切除原发性肺瘤后）。对于原位前列 腺癌细胞注射，将2X106活的LN4或细胞注射到小鼠的前列腺中。
[0169] 对于体内确定转移瘤负荷，将小鼠麻醉并且腹膜内注射75mg/kg的D-萤光素 (10(^1^，在？83中3〇11^/1^)。在〇-萤光素注射后5分钟，在仰卧位的小鼠中用与1^"1^ Imageacquisition和分析软件（Xenogen)偶联的XenogenIVIS系统使用生物发光监测转 移瘤随时间的生长。对于BLI图，通过使用包围小鼠胸的目的相同圆形区域计算每只小鼠 的光子通量。
[0170] 施用Psap肽
[0171] 用在PBS中稀释的Psap肽（例如，DWLPK(SEQIDNO:2)、DWLP(SEQIDNO:3)或 其修饰形式）通过腹膜内注射以30mg/kg/天的剂量处理8周大的小鼠达2周。
[0172] 结果
[0173] 测量来自患有癌症之人对象的组织样品中的⑶36水平。
[0174] 将癌细胞系中的⑶36水平敲减并且用这些具有降低的⑶36的细胞系注射小鼠。 然后向小鼠施用Psap肽。监测肿瘤生长和转移瘤负荷。预计敲减癌细胞中的CD36将降低 体内Psap肽的抗癌活性。
[0175] 实施例3
[0176] 方法
[0177] 除非另有说明，否则实施例3中使用的方法与实施例1和2中使用的方法相同。 测试CD36表达的细胞系是胰腺癌（AsPCl)、卵巢癌（DF-14和ID-8)、乳腺癌（MDA-MB231和 LM2)、前列腺癌（PC3、PC3-M-LN4、LN-CAP和LN-CAP-LN3)、黑素瘤（(B16-B16)和肺癌（LLC) 细胞系。所有这些细胞系是本领域中已知的和/或市售的。
[0178] 用对照或血小板反应蛋白（Tsp-1，100ng、500ng或1000ng)处理表达CD36的卵巢 癌细胞，并且在〇小时或48小时测量存活细胞的百分比。
[0179] 对于卵巢癌小鼠模型，腹膜内注射1百万个表达萤光素酶的卵巢癌细胞。17天后 开始用顺铂（4mg/kgQ0D)、Psap肽dWlP(SEQIDN0:47,40mg/kgQD)、顺铂和psap肽的组 合或PBSQD处理。从约17天开始在数天测量萤光素酶强度，并且随时间测量。
[0180] 对于胰腺癌小鼠模型，将1X106AsPc1人胰腺细胞注射到SCID小鼠的胰腺中。用 对照或用Psap肽dWlP(SEQIDNO:47,20mg/kg/天或40/mg/kg/天）处理小鼠。在第25 天开始处理并每天继续，持续21天。然后对小鼠进行安乐死，并且测量原发性肿瘤块。还 测量腹水是否存在。
[0181] 对于黑素瘤小鼠模型，将B16-B16细胞注射到小鼠中。用psap肽dWlP(SEQIDN0: 47,10或40/mg/kg)或对照处理小鼠。随时间测量肿瘤体积，直到细胞注射后约20-25天。
[0182] 结果
[0183] 测试了多个癌细胞系的CD36表达。发现在所有测试的细胞系中均可检测到CD36 蛋白，其中在AsPCl、DF-14、MDA-MB231和PC3细胞系中可检测到特别高的⑶36水平（图 5) 〇
[0184] 已示出表达CD36的卵巢细胞以剂量依赖的方式对Tsp-1介导的细胞杀伤敏感 (图 6)。
[0185] 将两个"高"CD36细胞系（卵巢癌细胞和AsPC胰腺癌细胞）和一个"低"CD36细胞 系（B16-B6癌细胞）注射到小鼠中以研究psap肽对肿瘤生长和转移的影响。发现"高"CD36 癌症模型响应于Psap肽治疗而消退（图5和7)。卵巢癌模型也示出转移性疾病的消退（图 5)。胰腺癌模型也示出对转移的抑制，因为19只用psap肽处理的小鼠中只有1只形成了腹 水，而10只用对照处理的小鼠中有4只形成了腹水。在"低"CD36黑素瘤模型中，发现Psap 肽治疗抑制了原发性肿瘤生长，但是不引起肿瘤消退（图8)。这些结果表明，"高"CD36癌 症更可能强烈响应于Psap肽治疗（例如，原发性肿瘤和/或转移的消退），而"低"CD36癌 症更可能具有较弱响应（例如，原发性肿瘤的抑制而非消退）。
[0186] 无需进一步详述，相信基于以上描述，本领域技术人员能够最大程度利用本公开 内容。因此，具体实施方案应解释为仅是说明性的，而无论如何不以任何方式限制本公开内 容的其余部分。为了本文所述目的或主题，本文引用的所有出版物均通过引用并入。
[0187] 本文在说明书和权利要求书中使用的未用数量词限定的名词应理解为意指"至少 一个/种"，除非明确指出相反情况。
[0188] 通过以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开内容的基本特征，并且在 不脱离其精神和范围的情况下，可对本公开内容进行多种改变和修改以使其适用于多种用 途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求的范围内。
【主权项】
1. 用于评估对象对Psap肽治疗的响应性的方法，所述方法包括： 确定从患有癌症之对象获得的样品中的CD36水平，其中与对照水平相比所述样品中 升高的CD36水平指示所述对象对Psap肽治疗有响应或可能有响应。2. 根据权利要求1所述的方法，其中通过进行测定来确定所述样品中的CD36水平。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括： 鉴定在所述样品中具有与对照水平相比升高的CD36水平的对象为对Psap肽治疗有响 应或可能有响应。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述方法还包括： 向被鉴定为对Psap肽治疗有响应或可能有响应的所述对象施用有效量的Psap肽以治 疗癌症。5. 用于治疗患有癌症之对象的方法，所述方法包括： 向患有癌症之对象施用有效量的Psap肽以治疗癌症，所述患有癌症之对象的特征在 于与对照水平相比样品中升高的CD36水平。6. 用于治疗患有癌症之对象的方法，所述方法包括： (a) 基于已知对象在样品中具有与对照水平相比升高的CD36水平来选择患有癌症的 对象，以及 (b) 因为所述对象在所述样品中具有与对照水平相比升高的CD36水平，所以向所述对 象施用有效量的Psap肽。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述对照水平是从所述患有癌症之 对象获得的非癌细胞或组织中的CD36水平。8. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述对照水平是从健康对象或健康 对象群体获得的细胞或组织中的CD36水平。9. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述对照水平是预定的水平。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述⑶36水平是⑶36蛋白水平。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、卵 巢癌、肺癌、白血病、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤或黑素瘤。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述Psap肽包含氨基酸序列 CDWLPK(SEQIDNO:l)、DWLPK(SEQIDNO:2)或DWLP(SEQIDNO:3)，或者其氨基酸替换变 体，其中所述氨基酸替换是： a) 酪氨酸⑴替换色氨酸（W); b) 选自缬氨酸（V)、丙氨酸（A)或甘氨酸（G)或者类似大小的非标准氨基酸或其衍生 物的氨基酸替换亮氨酸（L); c) 精氨酸（R)替换赖氨酸（K); d) 天冬氨酸（D)的D-异构体替换天冬氨酸（D)的L-异构体和/或亮氨酸（L)的D-异 构体替换亮氨酸（L)的L-异构体； e) 色氨酸（W)的D-异构体替换色氨酸（W)的L-异构体和/或脯氨酸（P)的D-异构 体替换脯氨酸（P)的L-异构体；或者其组合。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述Psap肽的长度为50个氨基酸或更少。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述Psap肽的长度为30个氨基酸或更少。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述Psap肽的长度为15个氨基酸或更少。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述Psap肽的长度为6个氨基酸或更少。17. 根据权利要求12所述的方法，其中所述Psap肽为环肽。18. 根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述类似大小的非标准氨基酸为 甲基缬氨酸、甲基亮氨酸或肌氨酸。19. 用于治疗患有癌症之对象的组合物，所述患有癌症之对象的特征在于与对照水平 相比样品中升高的⑶36水平，所述组合物包含Psap肽。20. 组合物在制造用于治疗患有癌症之对象的药物中的用途，所述患有癌症之对象的 特征在于与对照水平相比样品中升高的⑶36水平，所述组合物包含Psap肽。21. 根据权利要求19或20所述的组合物或用途，其中所述对照水平是从所述患有癌症 之对象获得的非癌细胞或组织中的⑶36水平。22. 根据权利要求19或20所述的组合物或用途，其中所述对照水平是从健康对象或健 康对象群体获得的细胞或组织中的CD36水平。23. 根据权利要求19或20所述的组合物或用途，其中所述对照水平是预定的水平。24. 根据权利要求19至23中任一项所述的组合物或用途，其中所述⑶36水平是⑶36 蛋白水平。25. 根据权利要求19至24中任一项所述的组合物或用途，其中所述癌症是前列腺癌、 乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤或黑素瘤。26. 根据权利要求19至25中任一项所述的组合物或用途，其中所述Psap肽包含氨基 酸序列CDWLPK(SEQIDNO:l)、DWLPK(SEQIDNO:2)或DWLP(SEQIDNO:3)，或者其氨基酸 替换变体，其中所述氨基酸替换是： a) 酪氨酸⑴替换色氨酸（W); b) 选自缬氨酸（V)、丙氨酸（A)或甘氨酸（G)或者类似大小的非标准氨基酸或其衍生 物的氨基酸替换亮氨酸（L); c) 精氨酸（R)替换赖氨酸（K); d) 天冬氨酸（D)的D-异构体替换天冬氨酸（D)的L-异构体和/或亮氨酸（L)的D-异 构体替换亮氨酸（L)的L-异构体； e) 色氨酸（W)的D-异构体替换色氨酸（W)的L-异构体和/或脯氨酸（P)的D-异构 体替换脯氨酸（P)的L-异构体；或者其组合。27. 根据权利要求26所述的组合物或用途，其中所述Psap肽的长度为50个氨基酸或 更少。28. 根据权利要求27所述的组合物或用途，其中所述Psap肽的长度为30个氨基酸或 更少。29. 根据权利要求28所述的组合物或用途，其中所述Psap肽的长度为15个氨基酸或 更少。30. 根据权利要求29所述的组合物或用途，其中所述Psap肽的长度为6个氨基酸或更 少。31. 根据权利要求26所述的组合物或用途，其中所述Psap肽为环肽。32. 根据权利要求26至31中任一项所述的组合物或用途，其中所述类似大小的非标准 氨基酸为甲基缬氨酸、甲基亮氨酸或肌氨酸。33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法、用途或组合物，其中所述样品是肿瘤样 品。
【专利摘要】本文提供了用于鉴定患有癌症之对象以用Psap肽治疗的方法。基于CD36水平鉴定所述对象。本文还提供了用于基于CD36水平治疗患有癌症之对象的组合物和方法。
【IPC分类】G01N33/50, G01N33/574, G01N33/53, C12Q1/68
【公开号】CN105358708
【申请号】CN201480014414
【发明人】伦道夫·S·瓦特尼克
【申请人】儿童医学中心公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年3月13日
【公告号】EP2971166A1, US20160033513, WO2014151840A1