有一个轻 基。HMBC 谱中，Η2-17 ( δ H5. 70 和 5. 55)，H2-H ( δ H3. 58 和 2. 09)和 Η2-12 ( δ H2. 69 和 2. 41)与含氧季碳的相关性验证了上述结论。ROESY谱中，H-I与Η-5 β和Me-18以及Η-15 与Η-14 α ( δ H2. 09)的相关性，表明的H-I和H-15为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱 和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型 进一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0022] 实施例2 :化合物（I )药理作用试验 一、材料和仪器 786-0肾癌细胞株、0S-RC-2肾癌细胞株均购自中科院细胞库。化合物（I )自制，HPLC 归一化纯度大于98%。RPMI-1640培养基、lOOU/mL青霉素及100 μ g/mL链霉素、I XPBS缓 冲液、胰酶-EDTA购于美国HyClone。胎牛血清购于美国Gibco。细胞增殖与毒性检测试剂 盒（中国）。基质胶购于美国BDBioscience。
[0023] HERAcell240i恒温孵箱、GmbHD-37520低温离心机、1510酶标仪为芬兰Thermo公 司产品。頂T-2倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。DFC480正置显微镜为德国徕卡 公司产品。MDF-U53V-80°C超低温冰箱为日本SANYO公司产品。YDS-50B-80液氮储存罐购 自中国成都液氮容器厂。BC-185GE 4°C冰箱为中国益友公司产品。Minispinplus小离心机 为Eppendorf公司产品。powerpac300电泳仪为美国Biorad公司产品。
[0024] 二、试验方法 1、细胞培养 (1)常规培养及细胞传代：786-0及0S-RC-2肾癌细胞株均培养在改良型RPMI-1640培 养基中，常规培养时加入了 10%胎牛血清及1%青霉素和链霉素，构成完全培养基。培养条 件为37°(：、5%0)2的恒温培养箱。正常情况下786-0及0S-RC-2细胞均为贴壁生长。每天 在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，一般隔天换液一次。换液时先吸去培养瓶或培养 皿中培养基，加 PBS洗漆2次后再加入完全培养基。细胞密度达到80-90%且细胞形态仍保 持良好时进行传代，传代周期一般为3天。细胞传代步骤如下：1)先弃去培养瓶内培养基， PBS洗2次；2)培养瓶内加 ImL胰蛋白酶-EDTA，37°C孵育约3分钟，倒置显微镜下观察细 胞变圆并脱落后，加入3mL完全培养基终止消化，并用吸管将成团的细胞吹散；3)细胞悬液 移至15mL离心管中，1000转/分离心5分钟，弃去上清，加入完全培养基吹散细胞沉淀，分 装到3个培养瓶中，置于37°C、5%C0 2中继续培养。
[0025] (2 )细胞冻存：细胞处于对数生长期，状态良好并且细胞密度达到80-90%冻存细 胞，步骤如下：1)配制细胞冻存液：将改良型RPMI-1640培养基、胎牛血清、DMSO按7:2:1 比例混合、震荡混匀；2)消化、离心细胞(具体见细胞传代步骤);3)离心后吸去上清液，加入 冻存液并吹匀，调整细胞计数约I X 107mL，移至I. 2mL冻存管中。在冻存管标记冻存日期及 细胞株信息，用封口膜封口。置于4°C冰箱30分钟，移至-20 °C冰箱2小时，再移至-80 °C冰 箱过夜，次日转入液氮中保存。
[0026] (3)细胞复苏：1)水浴锅预热到37°C准备；2)从_80°C冰箱或液氮中取出细胞，迅 速放入37°C的水浴锅中并摇动，使其内液体在1-2分钟内融化；3)将融化后的细胞悬液移 置15mL离心管中，1000转/分钟离心5分钟，离心后弃去上清并加入完全培养基。4)将细 胞置于37°C、5%C0 2培养箱中培养，次日观察细胞状态并换液。
[0027] (4)细胞计数：1)细胞消化，吹散制备细胞悬液，方法同细胞传代。用加样器吸取 20 μ L悬液沿盖玻片边缘烧靠外侧滴加，使悬液由于气压影响均匀吸入计数察，健康活细胞 呈规则圆形、透明状。计算计数板4个角的4大格内细胞数(格子边线上的细胞只记上边、 不计下边；只记左边、不记右边)。细胞密度=4大格细胞总数Χ0. 25Χ 107mL。
[0028] 2、细胞增殖曲线绘制 (1)当786-0及0S-RC-2细胞处于对数生长期，密度80-90%时，制备细胞悬液并细胞 计数，方法同上。调节细胞悬液浓度为IX IOVmL ; (2)接种细胞悬液ImL接种于于24孔板 上，然后再根据不同条件加药，保证每孔细胞数基本一致。同一种细胞同一种加药条件设计 计数6天，每天计数3个孔，即每种条件需设置18个孔；（3)将培养板置于37°C、5%C0 2中培 养；（4)从接种次日开始计数，记为第1天(第0天细胞数记为接种细胞数，即I X 105)。每 孔加200 μ L胰酶-EDTA，消化、吹散、计数即可。每隔24小时取3个孔进行细胞计数；（5) 根据计数所得数据绘制细胞生长曲线。
[0029] 3、WST-8细胞活力实验 (1)收集对数生长期的786-0及0S-RC-2细胞，制备细胞悬液、细胞计数，方法同上。调 节细胞悬液浓度为4X IO4HiL ; (2)每孔中加入50 μ L细胞悬液（即2000个细胞/孔)，然后 各逾加入含有设计值2倍浓度药物的完全培养基50 μ L混勾，这样使药物终浓度恰好为设 计值，且保证了各孔细胞数的一致性。每个条件设置5个复孔；（3)将细胞置于5%C02、37°C 条件下的细胞培养箱中孵育；（4)分别在24小时和48小时后终止培养，吸取孔内培养基， 更换新鲜完全培养基，每孔加入10 μ L WST-8溶液，用加了新鲜完全培养基和WST-I溶液但 没有接种细胞的孔作为空白对照；（5)避光条件下置于摇床5分钟摇勾，后继续放入37°C、 5%C0 2条件下培养箱中培养1小时；（6)酶标仪下测定450nm吸光度值；（7)细胞活性抑制 率=(对照组吸光度值-实验组吸光度值）/(对照组吸光度值/空白组吸光度值）X 100%。
[0030] 4、划痕细胞迀移实验 (1)准备无菌6孔细胞培养板，marker笔在6孔板背面每隔Icm划一道标线；（2)取对 数生长期细胞，PBS液洗漆2次，0. 25%胰蛋白酶消化、吹散，将细胞悬液离心，更换完全培养 基重悬。接种于标记好的6孔培养板中培养，每孔加5X105细胞；（3) 37°C、5C02培养，待 倒置相差显微镜下观察各孔细胞密度约达到90%时吸取完全培养基，换用无血清培养基培 养24小时，以消除由于血清引起的增殖对迀移作用的干扰；（6)无血清培养到指定时间后 用高压消毒的200 μ L枪头垂直6孔板上的标记线划痕。划痕与孔板上mark笔上的横线交 叉点即为观察的固定点。（7)PBS清洗2次洗去划下的细胞。更换新鲜的无血清培养基，按 照实验条件在各组培养基中加入相应浓度的药物，同时设立对照组，置37°C、5C0J?箱中培 养；（6)每个孔取8个固定点观察划痕后12h、18h的细胞迀移情况并照相，使用ImageJ图 像分析软件测定每张图片划痕区的面积；（8)迀移率=(观察时间固定点划痕面积-起始时 间固定点划痕面积)/起始时间固定点划痕面积X 100%。迀移抑制率=(实验组迀移率-对 照组迀移率）/实验组迀移率X 100%。
[0031] 5、Transwell细胞侵袭实验 (1)取培养在完全培养基中的对数生长期786-0和0S-RC-2肾癌细胞株，PBS洗漆2次， 换用无血清的RPMI-1640培养基培养12小时，以减少细胞增殖对侵袭实验的影响；（2)准 备Transwell小室。小室可搭置于24孔细胞培养板上，底面为直径6. 5mm、孔径5 μπι的膜。 取40 yL以1:5稀释的lmg/mL基质胶铺在上室，并放入4°C过夜风干，该操作需在冰上完 成，因基质胶在室温下易迅速凝固；（3) 786-0和0S-RC-2肾癌细胞株经无血清RPMI-1640 培养基培养到12小时后，胰酶-EDTA消化、离心后吸去上清，加入无血清的RPMI-1640培养 基重悬，细胞计数调整细胞浓度至I X IOVmL ; (4)将准备好的带有Transwell小室的24孔 板取出，下室（即24孔板的孔）中加入500 μ L含有10%胎牛血清的完全培养基，以提供对 细胞的趋化作用。将上室搭在孔上，此时可见上室底面的膜刚好浸在了下室中的培养基里。 观察下室的培养基与上室底面的膜之间没有气泡即可；（5)取50 μ L细胞悬液加在各个孔 的上室，再加入含有不同浓度药物的无血清RPMI-1640培养基50 μ L，使各个孔上室药物的 浓度达到实验设计浓度。观察各孔中没有气泡；（6)将细胞放入37°C、5C02的恒温培养箱 中培养12小时，取出上室。用棉棒轻柔擦拭小室膜的上面，将没有穿过膜的细胞擦掉；（7) 将小室用PBS轻柔冲洗，洗去表面的培养基；（