一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于乳制品分离领域，特别涉及一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]乳铁蛋白分子的主体是一个相对分子质量约为80000的单肽链，并连接1-2个配糖体。乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中(包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞)，人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml,是牛乳中的10倍(牛乳中含量为0.02-0.35mg/ml)，占普通母乳总蛋白的20%，在泌乳期间，乳铁蛋白含量随着泌乳时间的不同而发生变化，如人初乳中乳铁蛋白可达6-14mg/ml，常乳期降至lmg/ml。
[0003]乳铁蛋白的主要作用功效是:
[0004]1.促进人体对铁的吸收。宝宝吮吸母乳后，在他的消化道内母乳中的乳铁蛋白会高亲和性地与铁结合，将铁运到小肠细胞内并释放出铁，以供给宝宝全身的需求。
[0005]2.乳铁蛋白另有一种特殊功能是具有抑菌、杀菌与抗病毒的作用，且对人体内的益生菌(如双歧杆菌)却并无害处。
[0006]3.乳铁蛋白还有促进和增强人体内的中性白细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的免疫作用，并且乳铁蛋白还对机体抗体的生成起调节完善作用，甚至有研究显示乳铁蛋白还可促进脑细胞和骨骼的生长，还有抗氧化的功能等等。
[0007]乳铁蛋白由于其强大的功能在婴幼儿配方产品、保健食品和发酵乳制品等领域的应用在许多发达国家已经为大家了解。乳铁蛋白作为食品添加剂在许多国家已被允许用于功能性食品中，并有试验证明其安全可靠，无副作用。美国食品药品管理局证实，乳铁蛋白不但可用于普通人群，而且可用于对牛奶过敏的特殊人群。
[0008]乳铁蛋白已经在一些发达国家如新西兰和澳大利亚实现工业化生产，通过运用超滤和冷冻干燥等技术，可以得到乳铁蛋白纯度超过90%的产品，同时保持产品的生物活性且不会有苦涩的味道，使之能够成功应用于保健食品和功能性食品中。
[0009]目前关于提纯乳铁蛋白(LF)的报道较多，最常用的方法是阳离子交换层析法，将奶制品离心脱脂，酸化脱酪或是凝乳酶脱酪，过层析柱，或用合适浓度的盐洗脱。然而各个方法结果之间有较大差异。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种快速有效、成本低、纯度高、回收率高，从转基因山羊乳汁中工业化分离人乳铁蛋白的方法。
[0011]在本发明的第一方面中，提供了一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法，包括步骤:
[0012](1)对转基因山羊乳汁进行离心处理和过滤处理，从而得到脱脂乳清；
[0013](2)对步骤(1)得到的脱脂乳清与弱酸性阳离子交换树脂进行搅拌吸附，从而得到吸附在该阳离子交换树脂上的脱脂乳清；
[0014](3)对步骤(2)得到的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清用洗涤剂洗涤，从而得到经洗涤的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清；
[0015](4)对步骤(3)得到的经洗涤的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清用洗脱剂进行洗脱，从而得到含人乳铁蛋白的洗脱液；
[0016](5)对步骤(4)得到的含人乳铁蛋白的洗脱液进行过滤，收集滤液；
[0017](6)对步骤(5)得到的滤液进行浓缩。
[0018]在另一优选例中，步骤(1)中，所述的离心处理为在45_60°C下，8000_10000r/min，离心15-30分钟；和/或步骤(1)中，所述的过滤处理为用纱布过滤。
[0019]在另一优选例中，所述的离心处理为在50-60°C下，8000-10000r/min，离心15-30分钟。
[0020]在另一优选例中，步骤(2)中，所述的弱酸性阳离子交换树脂为724树脂；和/或步骤(2)中，所述的弱酸性阳离子交换树脂和脱脂乳清的重量比为1:3 — 1:1 ;较佳地，为
3:7。
[0021]在另一优选例中，步骤(2)中，所述的搅拌吸附进行4-8小时；和/或步骤(2)中，所述的搅拌吸附是在4-20°C下进行；和/或步骤(2)中，所述的搅拌吸附是在50-200r/min的转速下进行。
[0022]在另一优选例中，步骤(3)中，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/L NaCl溶液；较佳地，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/L NaCl磷酸盐缓冲液。
[0023]在另一优选例中，所述洗涤剂为0.1-0.5mol/L NaCl磷酸盐缓冲液，pH7.4。
[0024]在另一优选例中，步骤(3)中，在用洗涤剂洗涤之前，先用纯水对步骤(2)得到的吸附在阳离子交换树脂上的脱脂乳清进行洗脱，至溶液澄清。
[0025]在另一优选例中，步骤(3)中，所述洗涤剂为1-5倍(优选为3倍)于树脂体积的
0.lmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，ρΗ7.4。
[0026]在另一优选例中，步骤(3)中，洗脱1-5次；较佳地，洗脱4次。
[0027]在另一优选例中，步骤(3)中，每次洗脱10-60分钟；较佳地，每次洗脱30分钟。
[0028]在另一优选例中，步骤⑷中，所述洗脱液为8 % ± 4 % NaCl溶液或5 % ± 2 %硫酸铵溶液；较佳地，所述洗脱液为8% ±4% NaCl磷酸盐缓冲液或5% ±2%硫酸铵水溶液。
[0029]在另一优选例中，步骤(4)中，所述洗脱液为等树脂体积的8%NaCl磷酸盐缓冲溶液或等树脂体积的5 %硫酸铵水溶液。
[0030]在另一优选例中，步骤⑷中，洗脱1-5次；较佳地，洗脱4次。
[0031]在另一优选例中，步骤(4)中，每次洗脱10-60分钟；较佳地，每次洗脱40分钟。
[0032]在另一优选例中，步骤(5)中，对步骤(4)得到的含人乳铁蛋白的洗脱液先用0.22微米的滤膜过滤，再用截留分子量为30000D的膜超滤，收集超滤液。
[0033]在另一优选例中，步骤￠)中，对步骤(5)得到的滤液进行浓缩脱盐。
[0034]在另一优选例中，在步骤(6)之后，还包括步骤:将对浓缩后的产品进行冻干。
[0035]在另一优选例中，在步骤(1)和步骤(2)之间，还包括对弱酸性阳离子交换树脂的预处理步骤:对弱酸性阳离子交换树脂依次经水、碱性溶液、酸性溶液、碱性溶液以及磷酸盐缓冲液处理。
[0036]在另一优选例中，所述碱性溶液为0.5-5% (较佳地，为3%或4% )的NaOH水溶液。
[0037]在另一优选例中，所述酸性溶液为1-5% (较佳地，为4% )的HC1水溶液。
[0038]在另一优选例中，所述磷酸缓冲液为0.05-0.5mol/L (较佳地，为0.2mol/L)的磷酸盐缓冲液，pH = 6.5。
[0039]在另一优选例中，所述磷酸缓冲液包括:0.2mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，pH = 6.5。
[0040]在另一优选例中，对弱酸性阳离子交换树脂依次进行如下处理:
[0041]先用水洗；
[0042]再用0.5-5 % (较佳地，为3 % )的NaOH水溶液搅拌浸泡4_6h，用纯水洗涤至流出液的 pH 值 7.5 ±0.2 ;
[0043]再用1-5 % (较佳地，为4% )的HC1水溶液搅拌浸泡4_6h，用纯水洗涤至流出液的 pH 值 5.5±0.2 ；
[0044]再用0.5-5 % (较佳地，为4 % )的NaOH水溶液搅拌浸泡4_6h，用纯水洗涤至流出液的pH值7.5±0.2 ;和
[0045]最后用0.05-0.5mol/L (较佳地，为0.2mol/L)的磷酸盐缓冲液，pH = 6.5，处理lh0
[0046]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附图说明】
[0047]图1为从转基因山羊乳汁中工业化提取人乳铁蛋白的工艺流程示意图。
[0048]图2为实施例2中，724树脂分离过程的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道Μ为蛋白分子量Marker ;泳道1为上样脱脂脱酪乳清；2是724树脂吸附后的洗脱液；3是用5%硫酸铵溶液洗脱后的洗脱液；泳道4是超滤后纯化的rhLF。
[0049]图3为对比例1中，732树脂纯化过程的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道Μ为蛋白分子量Marker ;泳道1是上样脱